水螨标本采集、保存及玻片标本制作

研究背景

水螨 (Water mite) 是其陆生祖先经次生适应转营水生生活的类群，栖息于江河、湖沼、溪流、瀑布、温泉等各种不同的淡水水体中，甚至少数类群入侵到江河入海口区域。水螨Hydrachnidia (= Hydrachnidiae) 是蛛形纲Arachnida，蜱螨亚纲Acari中一个物种数量巨大的类群 (金道超，1997)。截至2020年7月1日，水螨物种数量已达到 7,500种 (Smit, 2020)。因而，水螨是研究生物多样性及其进化演化研究的优质对象。
        水螨螨体较小 (小型类群体长约150 μm，大型类群达5000 μm，多数类群体长约500-1000 μm)，对水环境变化极敏感，水体的轻微污染也可导致水螨种群锐减，甚至是灭绝，因而水螨是生境水体质量优劣的指示性生物 (Walter, 1918; Illies, 1954; Schwoerbel, 1961a and 1961b; Nair, 1981)。
        此外，水螨生活史分为卵、幼螨、第一若螨、第二若螨、第三若螨和成螨；其幼螨营寄生性生活，主要寄生于双翅目、蜻蜓目等昆虫 (如：孑孓、水虿等) 体表，其寄生情况对寄主繁殖力、取食量等均有一定影响，严重时可以使蚊类幼虫死亡；其成螨又可捕食小型水生节肢动物的卵和幼体等。因而，水螨又是潜在的生物防治因子 (Viets, 1926；付加才等，2009)。
        综上，水螨是生物多样性、生物进化与演化、水质监测、生物防治等研究领域的优良材料。然由于对水螨认知极其不足，严重阻滞了水螨在生产、科研中的应用。本文详尽阐述了水螨的样本采集与处理和玻片标本的制作方法等，以期为水螨未来研究提供参考。

一、材料与工具

1. 主要仪器设备
   双目解剖镜Motic SMZ-168、生物显微镜Leica DM 3000。
2. 主要工具
   采集工具：昆虫杆、采集网 (用75-100目的尼龙沙筛网制成，网口直径约30 cm，网深约35 cm，网底直径约8 cm)、双层叠合分样筛 (上层孔径为5目，下层80目)、白瓷盘、吸管 (1.5 ml) 离心管 (2 ml)、水桶等。
   制片工具：单凹载玻片、盖玻片、平口镊子 (小号)、解剖环 (图1)、解剖针、多孔滴定盘、小型加热器 (可用加热杯垫代替)。
   
   
   图1. 解剖环
   
   
3. 试剂及其配制方法
   1)

   Koenike液
   Koenike液：冰醋酸10 mL、甘油45 mL蒸馏水45 mL。
           按上述比例配方，在通风橱下依次加入甘油、冰醋酸及蒸馏水，用玻璃棒搅拌均匀，转入玻璃瓶即可。
           Koenike液是水螨样本的常规保存液，该保存液能使螨体组织和附肢保持柔软和自然舒张或可弯曲的状态而不发生皱缩、脱水等现象，能较好的避免标本在解剖或封固时发生破裂，有助于后续的解剖与观察。
   2)

   Lundblad液
   Lundblad液：水合三氯乙醛125 g、苯酚112.5 g、蒸馏水12.5 mL。
           按上述比例配方，在通风橱下，先加入水合三氯乙醛、苯酚及蒸馏水，用加热器加热，边用玻璃棒搅拌，直至完全溶解，均匀、无颗粒，转入棕色玻璃瓶避光保存即可。
           Lundblad液主要用于水螨样本的蚀洗，腐蚀其内脏和肌肉组织，使其螨体透明，更便于后续解剖及形态观察。
   3)

   明胶封固液
   明胶封固液：明胶8-10 g、苯酚0.8 g、甘油50 ml、蒸馏水50 ml。
           在烧杯中按照上述比例配方加入明胶、苯酚、甘油、蒸馏水，用酒精灯或加热器加热，同时用玻璃棒搅拌，待其完全溶解，均匀、无颗粒后，转入棕色玻璃瓶冷却，避光保存即可。
   明胶封固液主要是在解剖和制片时的基底液，主要起封固作用。
   此外，制作玻片标本时，还需使用封片剂 (无色透明指甲油、阿拉伯树胶或加拿大树胶)，通常封片剂直接购买成品即可。
   

   
   

1. 采集方法
   流水水域：可将采集网置于流水水底，网口与水流方向相对，用脚刮洗网口前的苔藓、石头等水底基物，使刮起的漂浮物进入采集网，反复多次 (图2 A)；后将网内打捞物翻倒至上层分样筛，同时用水桶盛水反复冲洗采集网，使所采集到的漂浮物尽数进入分样筛，并再多次冲洗分样筛内漂浮物，使采集到的螨类标本尽可能的进入到下层分样筛 (图2 B)；弃上层杂物，将分样筛下层滤过物倒入白瓷盘，加适量水 (刚好没过滤过物即可)，静置5-15 min (图2 C)便可看见水螨游动，此时用吸管收集即可 (图2 D-F)。
   
   
   图2. 水螨采集流程图: A. 采集；B. 冲洗；C. 静置；D-F. 收集.
   
   静水水域：采集过程尽可能选取水草或其它附着物较多处进行采集，采集时在水中快速来回扫网，并用网圈刮擦水草根部。待扫网完成后，便可进行后续冲洗、静置等处理，详细操作过程同流水采集方法。
2. 标本保存
   水螨样本采用Koenike液 (使螨体保持舒展而不发生皱缩) 进行保存。野外采获的标本需立即投入Koenike液中进行保存，并详细记录采集相关信息以及采集标签；一周后更换一次Koenike液便可进行长期保存。若用于分子实验的样本则采用无水乙醇进行保存。
   
   
   

1. 标本蚀洗
   将Koenike液保存的水螨标本取出，置于多孔滴定板，加入Lundblad液中进行蚀洗。不同类群的样本蚀洗时间不等，如急流水螨、雄尾螨等骨化程度较强的类群蚀洗时间通常较长，需12 h以上至1周；而骨化程度较弱的类群 (如蚌螨、腺水螨等) 则只需蚀洗3-6 h即可。进行蚀洗时，需注意：若蚀洗时间过短，会使螨体内部组织溶解不够，螨体透明程度也会不足，影响后续解剖和观察；而时间过长，则会蚀化过度，螨体附肢发生肢解，严重时一碰则碎。蚀洗完成后，将标本转入盛Koenike液的滴定板中或装有Koenike液的离心管中进行清洗 (可手动震荡加速清洗)，通常经5-15 min即可完成清洗。
2. 标本解剖
   将热熔的明胶封固剂滴于载玻片上的清洁盖玻片正中，将蚀洗后的螨体置于其中，在解剖镜下进行解剖。首先，用解剖环轻压固定螨体，并用解剖针自颚湾背面或腹面插入，向外拉卸颚体，使颚体脱离螨体；随后用解剖针轻轻取下须肢、螯肢，即可完成颚体解剖。其次，利用解剖环轻轻挤压固定螨体，将解剖针自足窝插入体内，或通过解剖针自足基节处挑起足缓慢绕足窝旋转，使足离体。
           完成标本的肢体离体解剖后，则需进行螨体洁腔。体壁柔软的螨体通过挤压螨体，使其内容物排出，并用解剖针轻轻将螨体支撑恢复原状，让明胶液进入螨体，反复多次，从而达到清洗目的。体壁骨化程度较高的螨体 (如急流水螨)，则可使用解剖针自背缝处插入，将背腹板分离后，直接进行洁腔处理 (若要观察或描述背缝，可在洁腔处理进行)。
   注：解剖过程中，明胶发生凝固时，需要将载玻片置于50 °C左右的加热器上热熔明胶。
3. 标本整肢
   将解剖、洁腔后的螨体移至盖玻片中心，螨体置于正中，须肢、螯肢、颚底位于螨体正前方，螨体两侧列足 (依足序放置)，所有附肢均应同向横置，并使标本各部沉于盖玻片底部，如图3所示。
   
   
   图3. 水螨玻片标本制作整肢图：A. 须肢；B. 颚底；C. 螯肢；D. 足I；E. 足II；F. 螨体；G. 足III；H. 足IV. 比例尺= 200 um.

1. 备片
   将热熔的明胶封固剂滴于载玻片正中凹孔内，通常1滴即可 (使盖玻片和载玻片上的明胶液刚好充满载玻片凹坑，而不会溢出)。
2. 盖片
   将盖玻片沿着载玻片明胶液体边缘慢慢靠近，缓慢盖上，待其凝固。
3. 封片
   用无色透明的指甲油或阿拉伯树胶、加拿大树胶沿盖玻片边缘涂抹一圈，静置待其阴干即可。
4. 贴标签
   将样本的采集签 (包含采集地、采集人、采集日期等) 贴于玻片标本的右侧，待鉴定完成后，将鉴定签贴于标本的左侧 (图4)。
   
   
   图4. 水螨玻片标本图

致谢

感谢贵州大学金道超教授对本实验方法的帮助与改进以及对水螨研究做出的贡献。本实验方法改自金道超 (1997) 和博士论文 (古欣瑶，2021)。

竞争性利益声明

作者声明没有利益冲突。

参考文献

1. 古欣瑶. (2021). 急流水螨科中国区系分类及其系统发育研究. 博士学位论文. 贵 州大学.
2. 付加才，樊天宝，江洪涛，王海防，王怀位，王新国. (2009). 山东南部滨湖地区 成蚊水螨寄生情况的调查研究. 中国热带医学 9(10): 1978-1979.
3. 金道超. (1997). 水螨分类理论和中国区系初志. 贵州科技出版社. 贵阳. ISBN: 7805845492.
4. Illies, J. (1954). Wassermilben (Hydrachnellae) aus der oberen Fulda. Berichte der Limnologischen Flußstation Freudenthal 6: 1-13.
5. Nair, G. A. (1981). Toxic effects of certain biocides on a fresh water mite, Hydrachna trilobata Viets (Arachnida: Hydrachnoidea: Hydrachnidae). J Environ Biol 2: 91-96.
6. Schwoerbel, J. (1961a). Die Bedeutung der Wassermilben für die biozönotische Gliederung. Verh Internat Verein Limnol 14: 355-361.
7. Schwoerbel, J. (1961b). Subterrane Wassermilben (Acari: Hydrachnellae, Porohalacaridae und Stygothrombiidae), ihre Ökologie und Bedeutung für die Abgrenzung eines aquatischen Lebensraumes zwischen Oberfläche und Grundwasser. Archiv fur Hydrobiologie Suppl 25: 242-306.
8. Viets, K. (1926). Versucheines Systems der Hydracarinen. Zool Anz 69: 192.
9. Walter, C. (1918). Hydracarinen. In: Steinmann, P. and Surbeck, G. (Eds.). In: Die Wirkung organischer Verunreinigungen auf die Fauna schweizerischer fließender Gewässer. Büchler, 436-438.