产品说明书：KAPA RNA HyperPrep试剂盒（Illumina^®平台）加RiboErase（HMR）Globin

产品描述

用于Illumina测序平台、KAPA RNA HyperPrep试剂盒加RiboErase（HMR）Globin包含去除rRNA和球蛋白mRNA转录物以及从25 ng-1 μg纯化的血源总RNA中构建Stranded RNA-Seq文库所需的所有缓冲液和酶，具体步骤如下：

1. 通过互补DNA寡核苷酸杂交和RNA酶H消化，去除与DNA寡核苷酸双链化的rRNA和球蛋白mRNA， 然后进行DNA酶处理以清除DNA寡核苷酸；
2. 采用加热和镁进行随机片段化；
3. 采用随机引物结合进行第一条链cDNA合成；
4. 结合第二条链合成和加A尾，将cDNA：RNA杂交体转化为双链cDNA（dscDNA），将dUTP掺入第二条cDNA链，进行Stranded RNA测序，并在所得dscDNA的3'末端加入dAMP；
5. 接头连接，即在文库插入片段上连接带有3' dTMP端的dsDNA接头；以及
6. 文库扩增，使用高保真低偏差PCR扩增在两端携带适当接头序列的文库片段。标记有dUTP的链未被扩增，允许进行链特异性测序。
   
   

该试剂盒提供了用于反应纯化的KAPA纯化磁珠，以及rRNA和球蛋白mRNA去除、cDNA合成、文库构建和扩增所需的所有酶和缓冲液。

反应缓冲液以方便的形式提供，包含所有需要的反应组分。这最大限度地降低了RNA酶污染的风险，确保了反应组分的一致性和均质性，并改善了重复样本之间的均一性。类似地，文库构建过程的每一个步骤都配有单独的酶混合物，从而减少了移液步骤的次数。

为了使序列覆盖均一性最大化，并维持相对的转录本丰度，尽量减少文库扩增偏差是至关重要的。KAPA HiFi DNA聚合酶是为低偏差高保真PCR而设计，是NGS文库扩增的首选聚合酶^{1, 2, 3, 4}。KAPA RNA HyperPrep试剂盒加RiboErase（HMR）Globin包含用于文库扩增的KAPA HiFi热启动高保真酶预混液（2X）和文库扩增引物混合物（10X）。

1. Oyola, S.O., et al. BMC Genomics 13, 1 (2012).
2. Quail, M.A., et al. Nature Methods 9, 10-11 (2012).
3. Quail, M.A., et al. BMC Genomics 13, 341 (2012).
4. Ross, M.G., et al. Genome Biology 14, R51 (2013).

产品应用

KAPA RNA HyperPrep试剂盒加RiboErase（HMR）Globin可用于手动操作或自动化操作,为总量为25 ng-1 μg的RNA进行NGS文库构建。该试剂盒可用于去除细胞质rRNA（5S、5.8S、18S和28S）和线粒体rRNA（12S和16S）及球蛋白mRNA转录物。该实验方法适用于多种类型的RNA测序应用，包括：

● 高质量和低质量RNA样本的基因表达分析；
● 单核苷酸多态性（SNV）分析；
● 剪切点和基因融合突变识别；以及
● PolyA和非PolyARNA的表征，包括非编码和未成熟的RNA。

该试剂盒与长度 < 100 bp的小RNA不兼容。

工作流程图

实验操作流程

1. 试剂准备
   完成该实验方法耗时约6.5小时。理想情况下，应根据需要准备流程中不同步骤的反应预混液。
   
   为获得最高的稳定性和最长的保质期，KAPA RNA HyperPrep试剂盒加RiboErase（HMR）Globin中的酶和反应缓冲液应单独提供。对于精简的实验方法，每一步酶促步骤都需要制备一份至少有10%多余量的试剂反应预混液，如表1-表7中所示。表8列出了KAPA RNA HyperPrep试剂盒加RiboErase（HMR）Globin实验方法中所需的其他试剂的量。
   
   始终确保寡核苷酸杂交、rRNA/球蛋白mRNA去除和DNA酶消化所需的试剂，以及KAPA纯化磁珠和PEG/氯化钠溶液在使用前已经完全平衡至室温。
   
   表1. 寡核苷酸杂交
   
   *如果要处理非血源样本或遵循KAPA RiboErase（HMR）工作流程，必须用相同体积的不含RNA酶的水（1 μl）代替球蛋白杂交寡核苷酸（HMR）。更多相关信息，请参阅含RiboErase（HMR）的KAPA RNA HyperPrep试剂盒技术数据表—KR1351 v2.17（或更高版本）。
   
   表2. rRNA/球蛋白mRNA的去除
   
   
   表3. DNA酶消化
   
   
   表4. 第一条链合成
   
   
   表5. 第二条链合成与加A尾
   
   
   表6. 接头连接
   
   
   表7. 文库扩增
   
   
   表8. 其他所需试剂的量
   
   
   
2. 寡核苷酸的杂交与rRNA/球蛋白mRNA的去除
   该实验方法需要25 ng-1 μg、溶解于不含RNA酶水中的血液来源10 μl 纯化总RNA。
   
   1. 确保在使用前已准备好了杂交反应预混液（表1）和去除反应预混液（表2），并保存在室温。
   2. 如果要处理非血源样本或遵循KAPA RiboErase（HMR）工作流程，必须用相同体积的不含RNA酶的水代替球蛋白杂交寡核苷酸（HMR）。更多相关信息，请参阅含RiboErase（HMR）的KAPA RNA HyperPrep试剂盒技术数据表—KR1351 v2.17（或更高版本）。
   3. rRNA和球蛋白mRNA的去除效率可用qRT-PCR评估，这需要过程对照物（不含RNA酶H）。有关更多信息，请参阅原说明书附录B。
   2.1

   按如下方式设置热循环仪的程序：
   
   
   
   2.2

   按下述方式配制rRNA/球蛋白mRNA杂交反应：
   
   
   
   2.3

   用10 μl的移液量上下吹打至少10次，以彻底混匀RNA和杂交反应预混液。
   2.4

   将样本置于预编程的热循环仪中，并执行程序。
   2.5

   确保添加了含有RNA酶H的去除反应预混液，同时样本在热循环仪中于45 °C下保存。当程序在45 °C下到达暂停步骤时，在每个20 μl杂交反应中添加以下物质，并用10 μl的移液量上下吹打至少10次，以彻底混匀。
   
   
   
   2.6

   恢复循环程序，继续进行去除步骤（45 °C，持续30分钟）。
   2.7

   立即进行rRNA/球蛋白mRNA去除纯化（步骤3）。
   
   
3. rRNA/球蛋白mRNA去除纯化
   
   3.1

   结合以下方法，进行一次2.2X基于磁珠的纯化：
   
   
   
   3.2

   通过多次上下吹打彻底重悬磁珠。
   3.3

   将板/管在室温下孵育5分钟，以将RNA结合到磁珠上。
   3.4

   将板/管放置在磁力架上以捕获磁珠。孵育直至液体澄清。
   3.5

   小心吸出并丢弃75 μl的上清液。
   3.6

   将板/管保持在磁力架上，加入200 μl 80%乙醇。
   3.7

   在室温下将板/管置于磁力架上孵育 ≥ 30秒。
   3.8

   小心吸出并丢弃乙醇。
   3.9

   将板/管保持在磁力架上，加入200 μl 80%乙醇。
   3.10

   在室温下将板/管置于磁力架上孵育 ≥ 30秒。
   3.11

   小心吸出并丢弃乙醇。在不搅动磁珠的情况下，尝试去除所有残留的乙醇。
   3.12

   在室温下将磁珠干燥3-5分钟，或直至所有乙醇挥发。
   注意：过度干燥磁珠可能会导致产量降低。
   
   
   
4. DNA酶消化
   为了从已去除RNA/球蛋白的RNA中去除杂交寡核苷酸，将样本与DNA酶一起孵育。
   注意：确保已制备了DNA酶消化反应预混液（表4），并保存在室温。
   
   4.1

   按下述方式配制DNA酶消化反应：
   
   
   

   4.2

   通过多次上下吹打彻底重悬磁珠。

   4.3

   将板/管在室温下孵育3分钟以从磁珠上洗脱RNA。

   4.4

   将板/管放置在磁力架上以捕获磁珠。孵育直至液体澄清。

   4.5

   仔细将20 μl的上清液转移到一个新的板/管中。丢弃带有磁珠的板/管。

   4.6

   采用如下实验方法孵育带有上清液的板/管。
   
   
   

   4.7

   立即进行DNA酶消化纯化（步骤5）。
   
   
5. DNA酶消化纯化
   
   5.1

   结合以下方法，进行一次2.2X基于磁珠的纯化：
   
   
   
   5.2

   通过多次上下吹打彻底重悬磁珠。
   5.3

   将板/管在室温下孵育5分钟，以将RNA结合到磁珠上。
   5.4

   将板/管放置在磁力架上以捕获磁珠。孵育直至液体澄清。
   5.5

   小心吸出并丢弃60 μl的上清液。
   5.6

   将板/管保持在磁力架上，加入200 μl 80%乙醇。
   5.7

   在室温下将板/管置于磁力架上孵育 ≥ 30秒。
   5.8

   小心吸出并丢弃乙醇。
   5.9

   将板/管保持在磁力架上，加入200 μl 80%乙醇。
   5.10

   在室温下将板/管置于磁力架上孵育 ≥ 30秒。
   5.11

   小心吸出并丢弃乙醇。在不搅动磁珠的情况下，尝试去除所有残留的乙醇。
   5.12

   在室温下将磁珠干燥3-5分钟，或直至所有乙醇挥发。
   注意：过度干燥磁珠可能会导致产量降低。
   
   
   
6. RNA洗脱、片段化和预备
   在片段化、预备和洗脱缓冲液（1X）中，将去除rRNA/球蛋白mRNA的总RNA从磁珠上洗脱，并在高温下通过孵育将其片段化成所需片段大小。
   注意：可选质控：rRNA和球蛋白mRNA的去除效率可用qRT-PCR评估，这需要过程对照物（不含RNA酶H）并遵循修改后的RNA洗脱方案。有关更多信息，请参阅原说明书附录B。
   
   6.1

   结合如下方法在室温下制备所需量的片段化、预备和洗脱缓冲液（1X）：
   
   
   

   6.2

   通过多次上下吹打，在22 μl的片段化、预备和洗脱缓冲液（1X）中，彻底重悬带有经过纯化和DNA酶处理的RNA的磁珠。

   6.3

   将板/管在室温下孵育3分钟以从磁珠上洗脱RNA。

   6.4

   将板/管放置在磁力架上以捕获磁珠。孵育直至液体澄清。

   6.5

   仔细将20 μl的上清液转移到一个新的板/管中。丢弃带有磁珠的板/管。
   安全停止点: 样本可以在-15 °C至-25 °C下储存 ≤ 24小时。准备好后，继续执行步骤6.6。

   6.6

   将板/管置于热循环仪中，并按照如下方法进行片段化和预备程序：
   
   
   

   6.7

   将板/管置于冰上，立即继续进行第一条链合成（步骤7）。
   
   
7. 第一条链合成
   
   7.1

   在冰上，按照如下所述配制第一条链合成反应：
   
   
   
   7.2

   将板/管置于冰上，通过多次轻轻上下吹打进行彻底混匀。
   7.3

   采用如下实验方法孵育板/管：
   
   
   
   7.4

   将板/管置于冰上，立即继续进行第二条链合成与加A尾（步骤8）。
   
   
8. 第二条链合成与加A尾
   
   8.1

   在冰上，按照如下所述配制第二条链合成与加A尾反应：
   
   
   8.2

   将板/管置于冰上，通过多次轻轻上下吹打进行彻底混匀。
   8.3

   采用如下实验方法孵育板/管。
   
   
   
   8.4

   将板/管置于冰上，立即继续进行接头连接（步骤9）。
   
   
9. 接头连接
   
   9.1

   稀释接头准备连接，目的是获得以下浓度：
   
   
   
   9.2

   在冰上，按照下述方式设置接头连接反应：
   
   
   
   9.3

   将板/管保存在冰上，通过多次上下吹打进行彻底混匀。
   9.4

   将板/管在20 °C下孵育15分钟。
   9.5

   立即进行第一次连接后纯化（步骤10）。
   
   
10. 第一次连接后纯化
    
    10.1

    结合以下方法，进行一次0.63X基于磁珠的纯化：
    
    
    
    10.2

    通过涡旋振荡和/或多次上下吹打进行彻底混匀。
    10.3

    将板/管在室温下孵育5-15分钟以将DNA结合到磁珠上。
    10.4

    将板/管放置在磁力架上以捕获磁珠。孵育直至液体澄清。
    10.5

    小心吸出并丢弃175 μl的上清液。
    10.6

    将板/管保持在磁力架上，加入200 μl 80%乙醇。
    10.7

    在室温下将板/管置于磁力架上孵育 ≥ 30秒。
    10.8

    小心吸出并丢弃乙醇。
    10.9

    将板/管保持在磁力架上，加入200 μl 80%乙醇。
    10.10

    在室温下将板/管置于磁力架上孵育≥30秒。
    10.11

    小心吸出并丢弃乙醇。在不搅动磁珠的情况下，尝试去除所有残留的乙醇。
    10.12

    在室温下将磁珠干燥3-5分钟，或直至所有乙醇挥发。
    注意：过度干燥磁珠可能会导致产量降低。
    
    10.13

    从磁力架上取下板/管。
    10.14

    在50 μl 10 mM的Tris-HCl（pH 8.0-8.5）中彻底重悬磁珠。
    10.15

    将板/管在室温下孵育2分钟以从磁珠上洗脱DNA。
    安全停止点：含有重悬磁珠的溶液可在2 °C至8 °C储存 ≤ 24小时。不要冰冻磁珠，因为这会导致DNA大量丢失。准备好后，进行第二次连接后纯化（步骤11）。
    
    
11. 第二次连接后纯化
    
    11.1

    结合以下方法，进行一次0.7X基于磁珠的纯化：
    
    
    
    11.2

    通过涡旋振荡和/或多次上下吹打进行彻底混匀。
    11.3

    将板/管在室温下孵育5-15分钟以将DNA结合到磁珠上。
    11.4

    将板/管置于磁力架上以捕获磁珠。孵育直至液体澄清。
    11.5

    小心吸出并丢弃80 μl的上清液。
    11.6

    将板/管保持在磁力架上，加入200 μl 80%乙醇。
    11.7

    在室温下将板/管置于磁力架上孵育 ≥ 30秒。
    11.8

    小心吸出并丢弃乙醇。
    11.9

    将板/管保持在磁力架上，加入200 μl 80%乙醇。
    11.10

    在室温下将板/管置于磁力架上孵育≥30秒。
    11.11

    小心吸出并丢弃乙醇。在不搅动磁珠的情况下，尝试去除所有残留的乙醇。
    11.12

    在室温下将磁珠干燥3-5分钟，或直至所有乙醇挥发。
    注意：过度干燥磁珠可能会导致产量降低。
    
    11.13

    从磁力架上取下板/管。
    11.14

    在22 μl 10 mM的Tris-HCl（pH 8.0-8.5）中彻底重悬磁珠。
    11.15

    将板/管在室温下孵育2分钟以从磁珠上洗脱DNA。
    11.16

    将板/管放置在磁力架上以捕获磁珠。孵育直至液体澄清。
    11.17

    将20 μl澄清的上清液移液到新的板/管中，并进行文库扩增（步骤12）。
    安全停止点：纯化的接头连接文库DNA可以在2 °C至8 °C下储存 ≤ 1周，或冰冻在-15 °C至-25 °C下储存≤1个月。准备好后，继续进行文库扩增（步骤12）。
    
    
12. 文库扩增
    
    12.1

    按如下方式配制每个文库扩增反应：
    
    
    
    12.2

    通过多次上下吹打进行充分混合。
    12.3

    使用以下热循环顺序扩增文库：
    
    *非标准（即除Illumina TruSeq外）接头/引物组合可能需要优化退火温度。
    
    
    12.4

    进行文库扩增纯化（步骤13）。
    
    
13. 文库扩增纯化
    
    13.1

    结合以下方法，进行一次1X基于磁珠的纯化：
    
    
    
    13.2

    通过涡旋振荡和/或多次上下吹打进行彻底混匀。
    13.3

    将板/管在室温下孵育5-5分钟以将DNA结合到磁珠上。
    13.4

    将板/管放置在磁力架上以捕获磁珠。孵育直至液体澄清。
    13.5

    小心吸出并丢弃95 μl的上清液。
    13.6

    将板/管保持在磁力架上，加入200 μl 80%乙醇。
    13.7

    在室温下将板/管置于磁力架上孵育 ≥ 30秒。
    13.8

    小心吸出并丢弃乙醇。
    13.9

    将板/管保持在磁力架上，加入200 μl 80%乙醇。
    13.10

    在室温下将板/管置于磁力架上孵育 ≥ 30秒。
    13.11

    小心吸出并丢弃乙醇。在不搅动磁珠的情况下，尝试去除所有残留的乙醇。
    13.12

    在室温下将磁珠干燥3-5分钟，或直至所有乙醇挥发。
    注意：过度干燥磁珠可能会导致产量降低。
    
    13.13

    在22 μl 10 mM的Tris-HCl（pH8.0-8.5）中彻底重悬已干燥的磁珠。
    13.14

    将板/管在室温下孵育2分钟以从磁珠上洗脱DNA。
    13.15

    将板/管放置在磁力架上以捕获磁珠。孵育直至液体澄清。
    13.16

    将20 μl澄清的上清液转移到一个新的板/管中，可将纯化的扩增文库在2 °C至8 °C下储存 ≤ 1周，或在-15 °C至-25 °C下长期储存。
    
    

使用过本产品的部分文献

1. Dreyer, S. B., Jamieson, N. B., Evers, L., Duthie, F., Cooke, S., Marshall, J., Beraldi, D., Knight, S., Upstill-Goddard, R., Dickson, E. J., Carter, C. R., McKay, C. J., Biankin, A. V. and Chang, D. K. (2019). Feasibility and clinical utility of endoscopic ultrasound guided biopsy of pancreatic cancer for next-generation molecular profiling. Chin Clin Oncol 8(2):
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7. Suntsova, M., Gaifullin, N., Allina, D., Reshetun, A., Li, X., Mendeleeva, L., Surin, V., Sergeeva, A., Spirin, P., Prassolov, V., Morgan, A., Garazha, A., Sorokin, M. and Buzdin, A. (2019). Atlas of RNA sequencing profiles for normal human tissues. Sci Data 6(1): 36.