肠道固有淋巴样细胞亚群分类及表型检测

材料与试剂

材料：

1. 15 ml离心管 (Corning, catalog number: 430791)
2. 5 ml离心管 (Axygen, catalog number: SCT-5ML-S)
3. 50 ml离心管 (Corning, catalog number: 430829)
4. 6 孔板 (Corning, catalog number: 3516)
5. 10 cm培养皿 (上海雷布斯，catalog number: 350003)
6. 眼用手术剪 (苏州市施强医疗器械有限公司，catalog number: JYY1030)
7. 眼用镊 (苏州市施强医疗器械有限公司，catalog number: JYN1030)
8. 70 μm滤膜 (Corning, catalog number: 352350)
9. 0.22 μm过滤器
10. 1.5 ml离心管 (Axygen, catalog number: MCT-150-C)
11. 10 ml移液管 (Corning, catalog number: 4488)
12. 3 ml圆头吸管 (Biologix，30-0138A1)
13. 96孔圆底板 (Corning, catalog number: 3360)
14. BD Falcon流式管 (Corning, catalog number: 352052)

1. Dnase I (Sigma-Aidrich，DN25-1G，配成150 mg/ml的母液-80 °C保存)
2. Type VIII Collagenase (Sigma-Aidrich，C2139-1G，配成100 KU/ml的母液-80 °C保存)
3. Lonsera乌拉圭 (南美) 特级胎牛血清 (Lonsera, catalog number: S711-001S)
4. 20x PBS缓冲液 (生工，catalog number: B548117)
5. 无水酒精 (常熟市鸿盛精细化工有限公司，catalog number: 64-17-5)
6. 0.5 M EDTA (生工，catalog number: B300599)
7. 二硫苏糖醇DTT (Sigma-Aldrich，catalog number: D9779-1G，配成1M母液-80 °C保存)
8. RPMI 1640培养基 (HyClone, catalog number: SH30809.01)
9. Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml) 双抗 (P/S, Gibco, catalog number: 15140-122) 
10. Percoll (GE Healthcare, catalog number: 17-0891-09)
11. eBioscience^TM Foxp3/Transcription Factor Staining Buffer Set (eBioscience^TM, catalog number: 00-5523-00)
12. Trypan Blue 0.4% solution in 0.85% NaCl (Lonza, catalog number: 17-942E)
13. 丙三醇
14.  Permeabilization Buffer
15. Fixation/Permeabilization Concentrate
16. Fixation/Permeabilization Diluent
17. 1x PBS (见溶液配方)
18. 75%酒精 (见溶液配方)
19. 洗液1 (见溶液配方)
20. 洗液2 (见溶液配方)
21. 消化液 (见溶液配方)
22. 1640完全培养基 (见溶液配方)
23. DNase I母液 (见溶液配方)
24. Collagenase VIII胶原酶母液 (见溶液配方)
25. 40% Percoll (见溶液配方)
26. 80% Percoll (见溶液配方)
27. 细胞活力染料溶液 (见溶液配方) 
28. FACS buffer (见溶液配方)
29. Block溶液 (见溶液配方)
30. 抗体混合物溶液 (见溶液配方)
31. Foxp3 Fixation/Permeabilization working solution (见溶液配方)
32. 1x Permeabilization Buffer (见溶液配方)

1. TruStainfcX^TM (anti-mouse CD16/32) (Biolegend, catalog number: 101320)
2. Fixable Viability Stain620 (PE-CF594) (BDBiosciences, catalog number: 564996)
3. Hamster Anti-Mouse CD3-PE-CF594 (BD Biosciences, catalog number: 562286)
4. Rat anti-mouse B220-PE-CF594 (BD Biosciences, catalog number: 562290)
5. Rat anti-mouseGr1-PE-CF594 (BD Biosciences, catalog number: 562710)
6. Rat anti-mouseCD11b-PE-CF594 (BD Biosciences, catalog number: 562287)
7. Hamster anti-mouseCD11c-PE-CF594 (BD Biosciences, catalog number: 562454)
8. MouseantimouseCD45.2-AlexFluor 700 (BDBiosciences, catalog number: 560693)
9. PE/Cy7 anti-mouse CD90.2 Antibody (Biolegend, catalog number: 105325)
10. Rat antimouseCD127-PE-Cy5 (eBioscience, catalog number: 15-1271-82)
11. APC anti-mouseCD25antibody (Biolegend, catalog number: 101909)
12. Rat antimouseST2-BV421 (BDBiosciences, catalog number: 566309)
13. Rat antimouseKLRG1-BB630 (BDBiosciences, catalog number: custom)
14. Rat antimouseMHC II-FITC (eBioscience, catalog number: 11-5321-82)
15. Rat antimouseCD69-BB780 (BDBiosciences, custom)
16. Rat antimouseIL17RB-BV605 (BDBiosciences, catalog number: 743817)
17. Mouse antimouseGATA3-BUV395 (BDBiosciences, catalog number: 565448),
18. Mouse antimouseRORγt-BV786 (BDBiosciences, catalog number: 564723)
19. Mouse antimouseT-bet-PE (BDBiosciences, catalog number: 561268)

仪器设备

1. 水平摇床 (其林贝尔，model: TS-100)
2. CO₂细胞培养箱 (Thermo Scientific^TM Heracell^TM 150i)
3. 实验室2级生物安全柜 (Thermo Scientific^TM 1300 Series A2 Biological Safety Cabinet Packages)
4. 高速离心机 (Thermo Scientific^TM Sorvall^TM ST 40 离心机)
5. 倒置相差显微镜 (Olympus, model: CKX41)
6. 血细胞计数板 (Sigma-Aldrich,model: BR717805-1EA)
7. X30流式细胞分析仪 (BD FACSymphony^TM系统)
8. 电动移液器 (Eppendorf, model: 4430000018)
   

实验步骤

一. 分离肠道固有层淋巴细胞

1. 将颈椎脱臼处死后的小鼠固定在手术台上，用75%酒精润湿并消毒小鼠腹部。剪开小鼠腹部皮肤后暴露腹腔。
2. 在小鼠胃与十二指肠连接处剪断，一边分离小肠周围脂肪组织和肠系膜，一边拉出小肠，之后在小肠和盲肠连接处剪断，从而分离出小肠，并将小肠放入装有10 ml 1x PBS (配制方法见溶液配方，后文中若无特殊说明PBS均指代1x PBS) 的15 ml离心管中，置于冰上等待后续操作。从盲肠末端开始至肛门部分的结直肠用同样的方法分离出来，放入装有10 ml PBS的15 ml离心管中，置于冰上。
3. 取出步骤2中的小肠，连同PBS一起倒入10 cm培养皿中，用手托起小肠一端，用眼科剪剪去小肠表面的派氏结 (Peyer’s Patches，PPs) 并用眼科镊小心去除表面所有的脂肪和肠系膜残余组织，再用剪刀纵向剪开小肠 (不必沿着肠系膜方向)，暴露出肠内容物，并在培养皿中涮洗干净。将小肠转移到已装有8 ml PBS的15 ml离心管中，并在转移过程中将小肠分成2 cm左右的小段，置于冰上。用相同的方法分离出干净的大肠 (图1)。
   
   
   图1. 去除小鼠小肠派氏结操作流程. A.去除表面脂肪和肠系膜等组织的小肠，红色箭头指示派氏结；B.剪去派氏结的操作示意图；C.去除派氏结后的小肠，红框是所有剪下来的派氏结。
   
   
4. 将所有装有肠道组织的离心管剧烈手动振荡2 min (视频1)。
   
   
   
   视频1. 手动震荡组织的方法
   
   
5. 现配现用含1 mM DTT的PBS洗液1 (见溶液配方)，含30 mM EDTA的PBS洗液2 (见溶液配方)。
6. 使用镊子直接将步骤4中的肠道组织取出并分别转移到装有10 ml洗液1的50 ml离心管中，220 rpm、37 °C水平摇床剧烈摇晃10 min。
   注：离心管垂直放置。
7. 取出离心管剧烈手动振荡2 min后，用镊子取出肠道组织再转到含有10 ml PBS的15 ml离心管中，再次手动振荡2 min。
8. 用镊子取出PBS清洗过的肠组织再分别转到装有10 ml洗液2的50 ml离心管中，220 rpm、37 °C水平摇床剧烈摇晃10 min。
   注：离心管垂直放置。
9. 取出离心管剧烈手动振荡2 min后，重复步骤8。
10. 从水平摇床中取出离心管，手动剧烈振荡2 min后用镊子将肠组织取出并转移到含有5 ml 1640完全培养基 (见溶液配方) 的7 ml离心管中，上下颠倒半分钟以清洗残留的洗液2。
11. 根据处理的组织数量现用现配消化液：消化一根小肠需要5 ml含有150 μg/ml DNase I及100 U/ml collagenase VIII的1640完全培养基。消化一根大肠需要5 ml含有150 μg/ml DNase I和200 U/ml collagenase VIII的1640完全培养基。
12. 用镊子取出步骤10中清洗过的肠道组织，置于装有消化液的六孔板中 (每孔加5 ml消化液)，再分别剪成0.5 cm左右的小段，在37 °C，5% CO₂浓度的CO₂培养箱中静置消化90 min。
13. 消化结束后，将每孔培养基和肠道组织转移到干净的15 ml离心管中，剧烈振荡3~5 min，待组织摇碎后，消化液及摇碎的组织经70 μm滤膜过滤，此外还可以用5~8 ml PBS清洗装过培养基的离心管并过滤收集，可以和前面经过过滤的组织液混合 (图2)。
    
    
    图2. 肠道组织经消化振荡后得到的细胞悬液示意图
    
    
14. 收集含有细胞的滤液，400 x g室温离心5 min得到细胞沉淀。
15. 现用现配40% percoll和80% percoll用于密度梯度离心。用4 ml 40% percoll重悬细胞沉淀并转移到15 ml离心管，用3 ml吸管吸取2.5 ml 80% percoll后深入15 ml离心管底部，缓慢加入percoll，形成密度梯度。800 x g室温离心20 min，升速 (ACC) 1，降速 (DEC) 0。
16. 离心结束后，吸取中间层淋巴细胞至10 ml PBS中，上下颠倒混匀，并用800 x g的速度室温离心10 min，去除上清后得到细胞沉淀 (图3，视频2)。
    
    
    图3. 密度梯度离心后得到的产物示意图
    
    
    
    视频2. 吸取密度梯度离心后中间层细胞的过程
    
    
17. 用5 ml PBS重悬细胞沉淀，400 x g、5 min室温离心后去除上清，得到肠道固有层淋巴细胞，活细胞计数后，可用于后续实验操作。

1. 固有淋巴样细胞根据其表达转录因子和分泌细胞因子的特征主要分成三个亚群，ILC1、ILC2、ILC3。先配置细胞活力染料溶液 (见溶液配方)、block溶液 (见溶液配方) 和抗体混合物溶液 (见溶液配方)。
   注：所有的流式抗体都需要避光操作，以防止荧光淬灭从而降低流式抗体的使用寿命；抗体开盖之前需要离心从而防止管壁上的抗体飞溅引起浪费；抗体不宜长时间在室温放置，建议置于冰上使用。
2. 取2 x 10⁶个需要检测的肠道固有层淋巴细胞于96孔板 (圆底) 或1.5 ml EP管中，用100 μl活力染料溶液重悬，4 °C冰上孵育半小时。
3. 加入150 μl FACS buffer (见溶液配方) (针对96孔板) 或500 μl FACS buffer (针对1.5 ml EP管) 清洗细胞，400 x g、4 °C离心5 min，去除上清后得到细胞沉淀。
4. 加入50 μl的block溶液充分重悬细胞，4 °C避光孵育10 min。
5. 在每个反应的细胞悬液中直接加入50 μl表面流式抗体混合溶液，充分混匀细胞后，4 °C避光孵育30 min，染色反应过程中建议适当吹打细胞悬液，以防止细胞聚集沉淀造成染色不充分。
6. 结束表面染色后，重复步骤3。
7. 现用现配Foxp3 Fixation/Permeabilization working solution (见溶液配方)，每个反应加入100 μl反应buffer，充分重悬细胞后，避光4 °C孵育1 h (固定破膜时间最多不超过18 h)。
8. 用双蒸水现用现配1x Permeabilization Buffer (见溶液配方)，每个反应加入150 μl buffer (针对96孔板) 或500 μl buffer (针对1.5 ml EP管)，400 x g、4 °C离心5 min，去除上清后得到细胞沉淀。、
9. 制备转录因子流式抗体混合溶液，按照1:200的稀释比例，用1x Permeabilization Buffer配置本实验中所用的的转录因子流式抗体 (T-bet、GATA3、RORγt)，充分混匀后，在每个反应中加入100 μl，充分重悬细胞，避光4 °C孵育40 min。
10. 结束孵育后，重复步骤3，最后用200~300 μl FACS buffer重悬细胞沉淀，再使用70 μm滤膜过滤到流式管中。
11. 流式细胞分析仪检测相关细胞参数。

结果与分析

图4. 小鼠大肠固有层固有淋巴样细胞亚群分布. 根据FSC、SSC即细胞的大小和所含内容物多少可圈出淋巴细胞，根据FSC-A和FSC-H可圈出单细胞群。Lineage^-CD45.2⁺CD127⁺CD90.2⁺可定义出总固有淋巴样细胞，其中T-bet⁺是ILC1，RORγt⁺是ILC3，GATA3⁺是ILC2。ILC1占lineage^-固有淋巴样细胞17.7%，ILC2占lineage^-固有淋巴样细胞44.4%，ILC3占lineage^-固有淋巴样细胞32.1%，还存在5.8%未知淋巴细胞。


图5. 小鼠小肠固有层固有淋巴样细胞亚群分布. 小肠中固有淋巴样细胞的亚群分布与大肠略有不同，其中ILC1占lineage^-固有淋巴样细胞12.1%，ILC2占lineage^-固有淋巴样细胞15.8%，ILC3占lineage^-固有淋巴样细胞68.2%，还存在3.9%未知淋巴细胞。

分离得到肠道固有层淋巴细胞后，可以在显微镜下观察计数，通过细胞的形状和台盼蓝染色判断制备细胞的状态。细胞活力高、状态好，方可进行后续的流式染色分析。固有淋巴样细胞主要居留在粘膜组织中，其中肠道固有层存在大量的ILC1、ILC2、ILC3。依据其不同亚群的分类标准，此次实验中，我们圈出lineage^- (即CD3^-B220^-CD11b^-CD11c^-Gr-1^-) CD45.2⁺CD90.2⁺CD127⁺的淋巴细胞单细胞群，其中，T-bet⁺为ILC1，RORγt⁺为ILC3，GATA3⁺为ILC2。已知ILC3具有较高的异质性，部分ILC3由于外界共生菌和Ahr信号的刺激，会上调T-bet的表达，并拥有产生IFNγ的能力 (Zook和Kee，2016)。因此可以发现，在图4中，我们定义的RORγt⁺ILC3亚群可分为T-bet⁺和T-bet^-两群。另外，ILC2表面高表达IL-2受体CD25、IL-33受体ST2、IL-25受体IL-17RB等，在常见的哮喘、过敏等二型免疫反应中，ILC2会接受上游IL-33、IL-25、TSLP等信号的刺激后活化，大量分泌二型细胞因子IL-5、IL-13等参与下游反应发挥功能 (Sonnenberg和Artis，2015)。因此在图4中，我们还观察了ILC2表面CD25的表达情况，发现肠道ILC2均高表达CD25。图4和图5分别展示了大小肠中固有淋巴样细胞的亚群分布，比较两图可知，大肠中的固有淋巴样细胞以ILC2为主，而小肠中的固有淋巴样细胞以ILC3为主。如果条件允许，实验者还可以加入各种感兴趣的细胞标记蛋白抗体，从而探索不同固有淋巴样细胞亚群的蛋白表达谱。


图6. 肠道二型固有淋巴样细胞表型分析. 所有流式图的细胞来自lineage^-CD45.2⁺CD90.2⁺CD127⁺淋巴细胞单细胞群。

  以二型固有淋巴样细胞为例，在图6中，我们观察了ILC2表面包括ST2、IL-17RB、CD25、KLRG1、CD69、MHC II等在内的不同蛋白的表达情况。之所以选择观察这些蛋白，主要是因为它们与ILC2的功能和状态相关：ST2、IL-17RB和CD25分别为ILC2感受上游信号IL-33，IL-25和IL-22的受体，CD69、KLRG1蛋白可判断细胞处于激活还是抑制状态，MHC II则与适应性免疫应答息息相关。其中ST2、CD25、KLRG1、CD69等均在ILC2表面高表达，与已有的文献报道一致；部分ILC2高表达MHC II，提示ILC2可作为抗原递呈细胞与辅助T细胞相互作用。除此以外，根据已有的研究发现，ILC2还表达OX40、PD-1等蛋白，参与适应性免疫调控等多种生理过程，本文不再一一描述，实验者可根据实验目的自行调整染色方案，检测固有淋巴样细胞的表型。

失败经验

1. 制备肠道固有层淋巴细胞失败
   初学者在制备细胞的过程中往往无法得到大量的细胞，主要原因在于消化不充分。为了避免这个问题，需要注意以下几点：1)在最初剥离肠道组织时，需要彻底清除肠壁周围的脂肪组织、肠系膜，它们的存在会严重影响后续的消化 (图7)；2)前三步洗涤过程的手动剧烈振荡一定不能省略，摇晃越剧烈越容易去除肠上皮，从而暴露固有层；3)消化组织使用的胶原酶和DNase I不能反复冻融，否则会大大降低酶活性，导致消化不足；4)如果在规定的消化时间内发现消化不彻底，可以适当延长消化时间或者提高酶浓度，如果发现消化过度、死细胞特别多，则需要减少消化时间或降低酶浓度。不同处理的小鼠其肠道组织环境差异巨大，需要摸索更优化的消化条件。
   
   
   图7. 肠道组织去除肠系膜和脂肪的前后对比图
   
   
2. 已知某亚群表达某一蛋白，但无法检测到
   无法检测到阳性信号主要有以下几个方面的原因，需要逐一排查：1)样品制备问题导致样品中缺乏阳性细胞，建议实验人员设计阳性对照以确定是否是实验组样品制备的问题；2)流式抗体问题，如果抗体本身由于克隆号或者过期等原因导致抗体失效，则建议更换抗体；3)流式染色和上机分析问题，建议对比其他表型检测有无问题，如果其他抗体检测正常则可排除流式操作的问题。
   

溶液配方

1. 1x PBS
   用双蒸水稀释20x PBS得到
   室温保存
2. 75%酒精
   取75 ml无水乙醇，用双蒸水定容至100 ml，配成75%酒精
3. 洗液1
   在1x PBS中加入终浓度为1 mM的DTT，即将1M DTT进行1,000倍稀释，现配现用
4. 洗液2
   在1x PBS中加入终浓度为30 mM的EDTA，即每10 ml PBS中加入0.6 ml 0.5 M EDTA母液，现配现用
5. 1640完全培养基
   在RPMI 1640培养基中加入终浓度为10%的FBS和1%的P/S
6. DNase I母液
   取1 ml丙三醇溶于9 ml 1x PBS，溶解后0.22 μm过滤
   取6.67 ml过滤后的溶液溶解1 g DNase，常温溶解且尽量不要搅动
   200 μl每管进行分装，可以反复冻融两到三次但不能太多次
7. Collagenase VIII胶原酶母液
   用无血清的RPMI1640培养基室温溶解胶原酶，配成100,000 Units/ml的母液
   需要分装，不能反复冻融
8. 消化液
   在1640完全培养基加入终浓度为150 μg/ml DNase I和100 U/ml (小肠) 或者200 U/ml (大肠) collagenase VIII，即将150 mg/ml DNase I母液1,000倍稀释，100 KU/ml collagenase VIII母液1,000倍或500倍稀释，现配现用
9. 40% percoll
   配4.4 ml 40% percoll需要0.18 ml 10x PBS、1.58 ml percoll、2.64 ml 1640完全培养基，现配现用
10. 80% percoll
    配2.75 ml 80% percoll需要0.22 ml 10x PBS、1.98 ml percoll、0.55 ml 1640完全培养基，现配现用
11. FACS buffer
    在1x PBS中加入终浓度为1%的FBS和2 mM的EDTA
    4 °C保存
12. 细胞活力染料溶液
    一个样品需要100 μl，取100 μl 1x PBS加入0.1 μl细胞活力染料Fixable Viability Stain 620 (PE-CF594)，1:1,000稀释，现用现配，注意避光
13. Foxp3 Fixation/Permeabilization working solution
    将1份Fixation/Permeabilization Concentrate和3份Fixation/Permeabilization Diluent充分混匀，现配现用
14. 1x Permeabilization Buffer
    用双蒸水稀释，10倍稀释10x Permeabilization Buffer，现配现用
15. Block溶液
    一个样品需要50 μl，取50 μl FACS buffer加入0.5 μl TruStainfcX^TM (anti-mouse CD16/32) 配成block 溶液，1:100稀释，现用现配，注意避光
16. 抗体混合物溶液
    染色反应总体积为100 μl，包括50 μl block溶液和50 μl抗体混合物溶液。因此，取43 μl FACS buffer各加入0.5 μl前文出现的所有表面抗体配成抗体混合物溶液(加入14种抗体共7 μl)，1:200稀释，现用现配，注意避光
    

致谢

感谢沈蕾实验室和中科院邱菊实验室各位研究生同学对本实验方法的帮助和改进。本实验得到国家自然科学基金项目 (81571533) 的资助。

参考文献

1. Sonnenberg, G. F. and Artis, D. (2015). Innate lymphoid cells in the initiation, regulation and resolution of inflammation. Nat Med 21(7):698-708.
2. Zook, E. C. and Kee, B. L. (2016). Development of innate lymphoid cells. Nat Immunol 17(7): 775-782.