基于单片机控制的果蝇睡眠剥夺方法

材料与试剂

1. 果蝇饲养瓶 (19.5 cm² × 10 cm无色玻璃)
2. 果蝇睡眠检测用管 (12.5 mm² × 6.5 cm无色玻璃)
3. 烧杯
4. 皮筋
5. 玻璃培养皿 (或者塑料皿)
6. 毛笔
7. 带孔塑料塞 (或棉花塞)
8. 果蝇，如：w¹¹¹⁸ (FlyBase ID：FBst0005905)
9. 红糖 (甘汁园纯正红糖)
10. 丙酸 (国药，沪试，catalog number：81011918)
11. 琼脂粉 (BIOSHARP JANPAN)
12. 睡眠监测期间果蝇食物 (见溶液配方)

仪器设备

1. 烘箱
2. 光照培养箱 (55 cm × 55 cm × 150 cm，宁波海曙赛福科技有限公司)
3. 体视显微镜 (Nikon SMZ745)
4. CO₂麻醉板 (Flystuff Flypad Frame，catalog number: 59-118)
5. 果蝇行为监测系统 (DAM2 Trikinetics，Waltham，MA，USA)
6. 多管漩涡混合器 (UMV-2，北京优晟联合科技有限公司，购于阿里巴巴平台)
7. 单路继电器模块 (天猫商城，telesky旗舰店)
8. 单片机控制四路继电器模块 (淘宝商城，海森豪电子网络营销部)
9. 直流电源 (DC12V 10A，天猫商城，NVVV君临专卖店)
   

软件

1. 数据收集软件DAMSystem

实验步骤

一、睡眠剥夺系统搭建

1. 改装混合器
   市场上购买的混合器，普遍具有较好的震荡效果，但是控制面板相对简单，无法实现时域或者频域控制。为解决这一问题，需要对混合器进行改装。
   
   1.1

   将混合器拆开，找到启动震荡的微动开关 (形状如图1A，位于图1B的Start/Stop按键下方)。从微动开关的任意两个对侧针脚，用锡焊焊接两根导线，两根导线另一端均引出到混合器之外 (图1B)。
   1.2

   将混合器重新安装完好，通电后检查混合器是否可以正常工作。特别注意，引出的导线可以直接控制混合器的启动，方为成功。在混合器通电的情况下，两根导线对接一次，混合器启动，再对接一次，混合器停止工作。故将引出线命名为Control line1和Control line2 (图1B)。
   
   
   图1. 微动开关与Control lines
   
   
   

2. 安放混合器
   2.1

   混合器震动产生巨大动能，故将其放入独立培养箱中。
   2.2

   混合器下部铺设海绵和垫片达到缓震效果 (图2A和2B)。
   2.3

   混合器的震荡转速设置为1,200~1,500 rpm为宜，可以根据实际情况进行调整。
   2.4

   Control lines用胶带固定，防止导线抖动导致接触不良。Control lines引出到培养箱之外，保证Control lines具有一定的长度 (> 20 cm)。
   
   
   图2. 混合器放置图
   
   

3. 单片机编程
   由于作者知识结构限制，在此仅做简要介绍，请有兴趣的读者自行学习单片机的设计和使用原理。
   图3所示的四路继电器单片机以及编码服务，购买于淘宝网店“海森豪电子网络营销部”，商品简要介绍见附录1，网址：
   https://ly889.taobao.com/index.htm?spm=2013.1.w5002-4171188017.2.5613196bxiaUZi
   大致流程如下：
   3.1

   图3A单片机使用KeilC51Vcngr编译器，需购买和安装该软件。
   3.2

   在编译器中编写代码，实现控制功能：当单片机接收到触发信号后，在170 s的时间区间内，随机选择一个时间点，闭合电磁继电器10 s后断开。
   3.3

   使用STC-ISP单片机下载编程烧录软件，将编写代码，通过STC下载器烧录至单片机中。
   
   
   
   图3. 单片机模块和继电器模块实物图
   
   

4. 单片机与继电器联合控制模块搭建
   增加继电器模块，方便震动间隔和震动时间的调节。使用telesky品牌一路继电器模块 (图3B)。telesky继电器模块使用说明见附录2。
   4.1

   按照图4连接单片机和继电器模块，注意接口不要连错。

   
   
   
   图4. 导线连接图
   
   
   4.2

   参照附录中telesky品牌一路继电器模块使用说明，设置参数，表1供参考。

   
   表1. 继电器参数设置
   
   
   
   4.3

   按信号控制顺序，设计介绍控制原理如下 (图5)：

   1)

   1号继电器模块控制震荡事件的时间区间长度，如表1和图5所示，时间区间长度为CL1 + OP1 = 195 s + 2 s = 197 s，设置循环数LOP1为无限循环。每个循环的第196 s，1号继电器模块闭合模块上的继电器，将高电平信号传输至单片机。

   2)

   单片机收到高电平信号后被触发，在170 s内，随机选择一个时间点闭合电磁继电器10 s。单片机在收到高电平信号3 min之后恢复待机状态，可以接受下一次触发信号。单片机的电磁继电器闭合后，将高电平信号同时传输至2号和3号继电器模块。

   3)

   2号继电器模块控制振荡事件的开始，在接收到来自单片机的高电平信号后被触发，通过闭合2号模块上的继电器，闭合Control line1和Control line2一次，启动震荡事件。2号模块上的继电器闭合OP2 = 10s之后断开，2号继电器模块进入待机状态。

   4)

   3号继电器模块控制震荡事件的持续时间，在接收到来自单片机的高电平信号后被触发，触发后，计时CL3 = 12s，计时结束后，通过闭合3号模块上的继电器，闭合Control line1和Control line2一次，停止震荡事件。闭合时间OP3 = 1s后，继电器断开，3号继电器模块进入待机状态。

   注：CL1和OP1控制时间区间长度，CL3控制震荡时间，按照控制逻辑，可以自行调节各参数，图表所示，是经过验证有效的一种设置方式。需要注意，当CL1 + OP1小于3 min时，会出现逻辑错误。如果实验需要CL1 + OP1小于3 min，则可以通过修改单片机代码实现。若实验需要CL1 + OP1大于3 min，则170 s + CL3之后的部分必然不会有震荡，导致随机性降低，但亦可以通过修改单片机代码，更改单片机选取随机时间的区间长度，根据实际操作经验，可控制必然非震荡时间 < (CL1+OP1) * 10%。需要注意，CL3 < OP2，也会导致逻辑错误。

   
   
   图5. 控制原理图
   

二、果蝇睡眠剥夺

1. 准备待测果蝇
   使用标准果蝇食物，在饲养瓶中饲养果蝇 (温度：25 °C，湿度：50%，光照：12 h光照/12 h黑暗)；监测果蝇年龄应在3~8天。
   
2. 准备监测用玻璃管
   2.1

   新的玻璃管壁残留游离碱，玻璃管置于烧杯在双蒸水中加入适量丙酸，煮沸5~10 min；用双蒸水清洗玻璃管两次，在双蒸水中煮沸5 min；用双蒸水清洗玻璃管一次，在双蒸水中煮沸5 min；用双蒸水清洗玻璃管一次。
   2.2

   用皮筋捆扎玻璃管，置于洁净的玻璃培养皿 (或者塑料皿) 中，双蒸水清洗玻璃管4 min，置于烘箱烘干。
   2.3

   使用饮用水，配制终浓度为5%红糖和1.5%琼脂的食物溶液，配制时使用微波加热煮沸5 min以上，间歇搅拌，待冷却至60 °C左右，每100 ml食物加入0.6 ml丙酸。
   2.4

   于洁净的玻璃培养皿 (或者塑料皿，皿深1.5 cm)中，倒满配制好的食物，迅速平稳放置捆扎好的玻璃管，待食物冷却凝固。
   2.5

   从烧杯中取出监测管，擦净监测管外壁残余食物，用塑料塞封住食物端。
   
3. 装配果蝇
   3.1

   用二氧化碳麻醉果蝇。
   注：由于二氧化碳麻醉会对果蝇产生不利影响，应尽量避免麻醉时间超过5 min。
   

   3.2

   用毛笔将果蝇移入监测管中 (一根监测管一只果蝇)。

   3.3

   将装入果蝇的监测管插入监测板中，并用带孔塑料塞 (或棉花塞) 封住非食物端。
   注：尽量将同一基因型同一性别的果蝇装在同一块监测板中，并准确记录果蝇基因型及其对应监测板号码和监测管位置。
   

   3.4

   待监测板上果蝇装配完成后，尽量使监测管中部 (无食物部分) 对准监测板上红外线发射/接收处，并用橡皮筋固定监测管，固定方法可参考图6A和图6B。
   
   
   
   图6. 玻璃管捆扎方法
   
   
   3.5

   将监测板放入预先设置好温度、湿度和时间参数的培养箱中，并用数据线 (美式标准) 将其与数据收集系统相连。 (例如8:00 a.m.开始，12 h光照/12 h黑暗，25 °C，湿度60%)
   3.6

   在电脑上打开数据收集软件DAMSystem，设置收集数据间隔为1 min并确认连接好的监测板已开始收集数据。
4. 果蝇睡眠剥夺
   4.1

   预先设置好睡眠剥夺培养箱的温度、湿度和时间等参数。

   4.2

   根据实验需求，选择合适的时间点，将检测板放入混合仪中固定 (图7)，并用数据线 (美式标准) 将其与数据收集系统相连，使睡眠剥夺时，可以同时检测果蝇的活动情况。
   
   
   
   图7. 检测板放置图
   
   
   4.3

   先接通混合仪电源，再接通单片机和继电器控制模块电源，睡眠剥夺实验即可开始。(例如8:00 a.m.开始，12 h光照/12 h黑暗的环境下，进行整夜睡眠剥夺。先进行两天的12 h光照/12 h黑暗检测，在第三天20:00 p.m.将检测板放入混合仪中固定，启动震荡系统后，于第四天8:00 a.m.结束震荡，将检测板放回培养箱中，连接数据收集系统，继续检测果蝇的活动情况。)
5. 果蝇睡眠剥夺数据分析
   DAMSystem生成的数据为txt格式文件，可以被多种分析软件读取。参见网址：www.trikinetics.com/或本书中“高通量分析果蝇睡眠的实验方法”。本章节作者使用Matlab和Excel宏命令处理，可以联系作者通讯地址获取。
   

溶液配方

1. 睡眠监测期间果蝇食物
   琼脂粉4.5 g
   蔗糖15 g
   丙酸1.85 ml
   双蒸水300 ml
   

致谢

感谢天猫商城telesky旗舰店、淘宝商城海森豪电子网络营销部，他们同意无偿公开产品部分技术说明，方便读者使用与参考。感谢童华威师兄在系统建立之初给予的帮助和指导。感谢国家自然科学基金项目 (31471031) 的支持。