果蝇无菌培养

材料与试剂

1. 1.5 ml离心管
2. 果蝇培养瓶 (Genesee Scientific, catalog number: 32-130)
3. Kimwipes纸巾 (Kimberly-Clark Worldwide, Inc., catalog number: 34155)
4. 果蝇胚胎收集笼 (Genesee Scientific, catalog number: 59-101)
5. 100 μm细胞滤网筛 (Corning Incorporated-Life Sciences, catalog number: 352360)
6. 博格利诺勾线笔
7. 50只雄果蝇和50只雌果蝇
8. PCR引物 (真细菌的通用引物27F和1492R)
   27F：5‘-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’
   1492R：5‘-GGYTACCTTGTTACGACTT-3’
9. 高糖型马利活性干酵母 (英联马利(北京)食品销售有限公司)
10. 84消毒液 (江苏爱特福84股份有限公司)
11. Ampicillin sodium (生工生物工程(上海)股份有限公司，catalog number: A610028)
12. Tetracyclinehydrochloride (生工生物工程(上海)股份有限公司，catalog number: A600504)
13. Rifamycin (生工生物工程(上海)股份有限公司，catalog number: A600808)
14. PCR试剂 (上海翊圣生物科技有限公司，catalog number: 10102ES08)
15. LB肉汤培养基 (生工生物工程(上海)股份有限公司，catalog number: A507002)
16. Agar A (生工生物工程(上海)股份有限公司，catalog number: A600010)
17. 蔗糖 (上海实验试剂有限公司)
18. 麦芽糖 (上海实验试剂有限公司)
19. 苯甲酸钠 (国药集团化学试剂有限公司，catalog number: 30164817)
20. 对羟基苯甲酸甲酯 (国药集团化学试剂有限公司，catalog number: 30119426)
21. 丙酸 (国药集团化学试剂有限公司，catalog number: 81011918)
22. 95%乙醇 (国药集团化学试剂有限公司，catalog number: 10009164)
23. 琼脂粉 (生工生物工程(上海)股份有限公司，catalog number: A505255)
24. 玉米粉 (上海仕林生物科技有限公司)
25. 黄豆粉 (上海仕林生物科技有限公司)
26. 食物平板 (见溶液配方)
27. 酵母泥 (见溶液配方)
28. 苹果汁板 (见溶液配方)
29. 固体平板 (见溶液配方)
30. 抗生素食物 (见溶液配方)
    

仪器设备

1. 果蝇培养箱 (Percival Scientific, Inc., model: DR-41VL)
2. 离心机 (Eppendorf)
3. 生物安全柜 (苏州净化，catalog number: SW-CJ-1D)
4. PCR仪 (BIO-RAD，model: T100^TMThermal Cycler)
5. 电饭锅 (上海元山电器工业有限公司，model: YS-RC20B08S)
6. 电泳槽 (BIO-RAD，catalog number: 170-4469)
7. 电泳电源 (BIO-RAD，catalog number:164-5052)
8. 凝胶成像仪 (Proteinsimple，model: SA-1000 [Red])
9. 立式压力蒸汽灭菌器 (上海申安医疗器械厂，model: LDZH-200KBS)
   

实验步骤

一、果蝇无菌培养

1. 果蝇培养条件：温度25 °C；湿度60%，光照时间段为早上7点至晚上7点。准备4个含有正常食物的果蝇培养瓶，每个培养瓶里各放50只雄果蝇和50只雌果蝇。
2. 3天后，倒掉果蝇成虫，每个培养瓶放一张kimwipes纸巾，增加蛹依附的空间，以收到更多的成虫。
3. 第10天开始收集成虫，共收集两天，并全部集中放到果蝇胚胎收集笼中 (约1,200只)，继续培养两天。
   注：
   1)  食物平板在上，减少果蝇成虫因密集而损失。收集卵时，苹果汁板在下，以便于短时间内收集大量的卵。
   2)  果蝇胚胎收集笼中放入2张kimwipes纸巾可以保持环境干燥。
4. 果蝇胚胎收集笼中培养的第三天，在食物平板上抹适量酵母，更换干净的果蝇胚胎收集笼和kimwipes纸巾。
5. 果蝇胚胎收集笼中培养的第四天开始预产卵，将果蝇转移至一个干净的果蝇胚胎收集笼中，换上抹有酵母泥的苹果汁板。
6. 每间隔2小时更换一个苹果汁板，将卵用100 μm的细胞滤网筛收集起来。
7. 用慢流速的自来水冲洗1分钟，避免直接对着卵操作，用干纸巾吸干水分。
8. 50%的84消毒液漂洗2分钟。
9. 重复步骤7一次。
10. 在生物安全柜中，70%的乙醇漂洗2分钟。
11. 重复步骤10一次。
12. 无菌水漂洗2分钟。
13. 重复步骤12一次。
14. 用干净的博格利诺勾线笔将适量的卵分装进抗生素食物中。
    注：抗生素食物预先用镊子捣碎，方便搁置卵。
15. 成虫出来后转移至抗生素食物管中，每间隔2~3天更换新的食物。
    
    

二、无菌果蝇验证 (Chen等，2014)

1. 以成虫果蝇匀浆为模板，PCR扩增16s rRNA (Weisburg等，1991)。
2. 将正常培养果蝇和无菌处理果蝇分别收集10只至1.5 ml的离心管中，均用无菌水洗三遍，再转移至固体平板上，直接用涂板的玻璃棒碾碎涂匀，37 °C倒置培养48 h，看是否会长菌。如图1所示，正常果蝇匀浆涂板48 h后，长出两个菌落 (红色方框所示)，而无菌处理的果蝇匀浆涂板48 h后则没有发现菌落。
   
   
   图1. 果蝇匀浆后涂板培养
   

溶液配方

1. 果蝇正常食物
   蔗糖320 g
   麦芽糖339.2 g
   高糖型马利活性干酵母200 g
   琼脂粉48 g
   黄豆粉73.44 g
   玉米粉534.6 g
   双蒸水8.9 L
   先用1 L双蒸水预混为匀浆，7.9 L双蒸水用电饭锅煮沸后缓慢倒入匀浆，煮20分钟，冷却至70 °C，加溶于20 ml 95%乙醇的对羟基苯甲酸甲酯2 g，苯甲酸钠8 g，丙酸55 ml，搅匀
   分装至10 cm平板 (20 ml每平板)
   分装至果蝇培养瓶 (30 ml每培养瓶)
2. 酵母泥
   5 g高糖型马利活性干酵母溶于8 ml双蒸水，混匀
3. 苹果汁板
   200 ml双蒸水
   100 ml苹果汁
   6 g琼脂
   微波炉煮沸，分装至10 cm平板
4. 固体平板
   2.5 g LB肉汤培养基
   3.0 g Agar A
   溶于100 ml双蒸水，高温灭菌，分装至10 cm平板
5. 抗生素食物
   1)

   果蝇管用紫外照射18小时
   2)

   用50%乙醇配制含有5mg/ml ampicillin sodium，500 μg/ml tetracyclinehydrochloride，2 mg/ml rifamycin的抗生素储存液，再取5 ml加入500 ml正常食物中，搅匀后分装
   注：
   

   1. 食物的温度一般在55 °C时加入抗生素，避免温度影响抗生素。
      
   2. 制备好的抗生素食物建议避光保存。
   3)

   对照组食物加入等量的50%乙醇

参考文献

1. Chen, H.Y., Zheng, X. B., Zheng,Y. X. (2014). Age-associated loss of lamin-B leads to systemic inflammation and gut hyperplasia. Cell 159: 829-843.
2. Weisburg, W. G., Barns, S. M., Pelletier, D. A., and Lane, D. J. (1991). 16S ribosomal DNA amplification for phylogenetic study. J Bacteriol 173: 697-703.