果蝇幼虫脂滴的标记观察

材料与试剂

1. 载玻片
2. 染色皿
3. EP管
4. 锡箔纸
5. 果蝇幼虫
6. 甘油
7. 指甲油
8. 1 mg/ml BODIPY494/503或0.5 mg/ml Nile red或LipidTOX母液
9. NaCl 
10. KCl 
11. Na₂PHO₄ 
12. KH₂PO₄ 
13. HCl
14. 多聚甲醛
15. 磷酸钠缓冲液
16. 双蒸水
17. 丙酮
18. DMSO或者无水乙醇
19. 1× PBS缓冲液 (见溶液配方)
20. 4% PFA溶液 (见溶液配方)
21. 4%甲醇溶液 (见溶液配方)
22. DAPI母液 (20 ng/μl) (见溶液配方)
23. Nile Red (见溶液配方)
24. BODIPY (见溶液配方)
    

仪器设备

1. 解剖镊
2. 高压蒸汽灭菌锅或过滤网
3. -20 °C冰箱
4. 激光共聚焦显微镜或蔡司荧光显微镜

实验步骤

1. 幼虫在实验条件下饲养到三龄幼虫Wandering时期。
2. 将适量PBS缓冲液滴于载玻片上，果蝇三龄幼虫置于液滴中。室温条件下，用解剖镊解剖，分离出脂肪体。将分离好的组织放于含有PBS缓冲液的染色皿中。
3.  吸干PBS缓冲液，用4%多聚甲醛 (PFA) 在室温下固定30 min。
4. 吸干PFA溶液，用PBS清洗3次，每次10 min。
5. 根据需要，用PBS按1:1,000稀释1 mg/ml的中性脂染料BODIPY494/503或按1:2,500稀释0.5 mg/ml Nile red或按1:100稀释的LipidTOX。染料室温染色1小时或4 °C过夜。染色时应注意避光。(Liu等，2014)
6. 吸干染料溶液，用PBS清洗3次，每次10 min。
7. 按照1:10稀释20 ng/μl DAPI母液，并染色5 min。染色时应注意避光。
8. 吸走DAPI，用PBS清洗3次，每次10 min。
9. 80%甘油压片，用指甲油封片。封片后应尽快进行拍摄。如需保存样品，应避光并放于4 °C。
10. 用激光共聚焦显微镜或者蔡司荧光显微镜扫描样品 (图1)。
    
    
    图1. 野生型果蝇三龄幼虫脂肪体脂滴染色. 蓝色荧光标示染料DAPI着色的细胞核；绿色荧光标示中性脂染料着色的脂滴；放大倍数：40倍。
    

溶液配方

1. 1× PBS缓冲液
   137 mmol/L NaCl
   2.7 mmol/L KCl
   10 mmol/L Na₂HPO₄
   2 mmol/L KH₂PO₄
   用800 ml蒸馏水溶解8 g NaCl，0.2 g KCl, 1.44 g Na₂PHO₄和0.24 g KH₂PO₄。用HCl调节溶液的pH值至7.4，加水至1 L。分装后在15 psi (1.05 kg/cm²) 高压蒸汽灭菌20 min，或过滤除菌，室温保存
2. 4% PFA
   10 g多聚甲醛溶解在0.1 M 磷酸钠缓冲液 (250 ml)，60 °C加热搅拌至澄清，调pH到7.4。配制好的溶液于4 °C保存
3. 4%甲醇溶液
   4 ml甲醇溶解于96 ml蒸馏水
4. DAPI母液 (1 mg/ml)
   10 mg DAPI粉末加入10 ml双蒸水中配制成1 mg/ml母液，分装在10个EP管中，用锡箔纸包裹，置于-20 °C冰箱保存。实际使用时，将母液1:5,000稀释
5. Nile Red (0.5 mg/ml)
   用丙酮配制0.5 mg/ml 的母液，配制好的溶液于4 °C保存。用时1:500~1:2,000稀释
6. BODIPY (1 mg/ml)
   用DMSO或者无水乙醇配制1 mg/ml母液，用时1:500~1:1,000稀释。配制好的溶液于4 °C保存
   

参考文献

1. Liu, Y., Wang, W., Shui, G. and Huang, X. (2014). CDP-diacylglycerol synthetase coordinates cell growth and fat storage through phosphatidylinositol metabolism and the insulin pathway. PLoS Genet 10(3): e1004172.