果蝇肠上皮的免疫荧光染色

材料与试剂

1. 移液枪头
2. 载玻片 (Fan Yi, catalog number: 7105P)
3. 盖玻片 (DIAMOND, 20 × 20 mm, 0.13-0.17 thick)
4. 1.5 ml离心管 (Axygen Scientific, catalog number: 07218934)
5. 0.22 μm滤器 (MILLEX, catalog number: R3MA68255)
6. 雌性果蝇成虫
7. 37%多聚甲醛 (Sigma-Aldrich, catalog number: F1635)
8. 甲醇 (Sigma-Aldrich, catalog number: 061495)
9. 正庚烷 (国药集团化学试剂有限公司, catalog number: 80066918)
10. 正常羊血清 (NGS, Cell Signaling Technology, catalog number: 5425)
11. 一抗：Dl小鼠1:500 (DSHB, catalog number: AB528194) 
12. 二抗：Alexa-Cy5山羊抗小鼠1:300 (Life Technology)
13. DNA荧光染料：DAPI (Sigma-Aldrich, catalog number: D9542)
14. Triton X-100 (Sigma-Aldrich, catalog number: T9248)
15. 甘油 (Sigma-Aldrich, catalog number: SHBC5602V)
16. NaHCO₃ (北京化工厂)
17. CaCl₂ (北京益利精细化学品有限公司)
18. NaOH (北京益利精细化学品有限公司)
19. HCl (国药集团化学试剂有限公司, catalog number: 10011018)
20. NaCl (北京化工厂)
21. KCl (北京益利精细化学品有限公司)
22. Na₂HPO₄ (北京化工厂)
23. KH₂PO₄ (北京益利精细化学品有限公司)
24. Schncider’s powdered medium (Sigma-Aldrich, catalog number: S9895)
25. Grace’s Insect Medium (见溶液配方)
26. 10× PBS (见溶液配方)
27. 1× PBS (见溶液配方)
28. PBT (见溶液配方)
    

仪器设备

1. 解剖板
2. 超精细解剖镊子 (WPI, Dumoxel合金镊子，#5 14098)
3. 体式光学显微镜 (Leica S6E)
4. 移液器 (GILSON)
5. 摇床 (Kylin Bell Lab Instruments)
6. 激光扫描共聚焦荧光显微镜 (Nikon A1或Zeiss LSM800)
7. 4 °C冰箱
   

实验步骤

1. 在Insect Medium (或1× PBS) 中解剖出完整的果蝇中肠，转移至盛有500 μl PBS的1.5 ml离心管中置于冰上。
   推荐解剖方法：
   
   1.1

   左右手各执一把镊子于体视镜下，取一只待解剖果蝇置于培养基润洗过的解剖板 (或直接在盛有培养基的槽中进行解剖)；
   1.2

   (可选) 根据操作习惯，通常用左镊子通过轻轻夹住果蝇身体两侧来固定住果蝇，右镊子夹住果蝇头胸部交界处夹断去掉果蝇头部；
   1.3

   (可选) 用同样的方法去掉果蝇的尾部体壁；
   1.4

   左镊子固定住果蝇胸部，右镊子夹住果蝇腹部两侧，轻轻向左右两端拖拽使果蝇胸腹交界处体壁破裂并暴露出果蝇肠道，继续向两端拖拽直至暴露出果蝇中肠末端；
   1.5

   通过左右镊子配合，一把镊子轻轻夹住肠道两侧固定肠道，另一把镊子拖拽果蝇体壁将肠道前端和后端分别从体壁中脱离出来 (图1A)；
   1.6

   用镊子夹断有大量马氏管的后肠部分和前端的食囊 (避免在后续染色过程中缠绕中肠，图1)；
   1.7

   轻轻剥离脂肪细丝等附着在肠道上的结构 (避免后续干扰成像效果)；
   1.8

   转移，用镊子将中肠挑入盛有培养基的1.5 ml离心管中，或用移液器将中肠和培养基一并转移至1.5 ml离心管中。
   
   
   图1. 果蝇成虫肠道解剖图及其分区. A. 体视镜下在解剖板上解剖出的果蝇成虫完整的肠道，包括前肠的食囊 (Crop) 和后肠的马氏管 (Malpighian tubules). B. 去掉食囊和马氏管并经过免疫荧光染色后的果蝇肠道，DAPI标记了细胞核。
   
   
2. 用4%多聚甲醛溶液及等体积的正庚烷置于旋转摇床上室温固定30 min (王晨辉，2013)。
3. 弃液，依次加入500 μl的正庚烷及500 μl 100%甲醇，剧烈摇晃30 s后弃液 (王晨辉，2013)。
4. 加入1 ml 100%甲醇置于旋转摇床上室温5 min (甲醇可以去除类脂并使细胞脱水，同时进一步固定并初步透膜，有利于降低背景信号，有利于肠道通过重力作用沉淀至离心管底，并使肠道结构不易被破坏，提高肠道的韧性避免相互缠绕)。
5. 弃液，重复步骤4。
6. 弃液，用1 ml PBT洗2~3次，置于旋转摇床上室温每次5 min (PBT中的Triton用于透膜)。
7. 弃液，用300 μl PBT + 15 μl NGS置于旋转摇床上室温封闭1 h (王晨辉，2013)。
8. 加入适当稀释比例的一抗 (本实验中用到的mouse-Dl 1:500)，置于旋转摇床上，室温杂交2~3 h，或4 °C杂交过夜。
9. 弃液，用1 ml PBT洗3次样品，室温置于旋转摇床上，每次5 min。
10. 弃液，加入300 μl PBT，并根据一抗的种属来源加入相应的荧光二抗 (本实验中用到的anti-mouse-Cy5 1:300)，置于旋转摇床上室温杂交2~3 h，或4 °C杂交过夜，避光。
11. 弃液，用1 ml PBT洗3次，置于旋转摇床上室温每次5 min。
12. 弃液，加入100 ng/μl的DAPI溶液，置于旋转摇床上室温染色5 min。
13. 弃液，用PBT洗2次，置于旋转摇床上室温每次5 min。
14. 弃液，加入150 μl 70%甘油，置于4 °C冰箱待甘油充分浸润肠道组织后 (约30 min) 制片。荧光染色样品置于-20 °C冰箱可保存数月。
    

结果与分析

野生型雌性果蝇成虫肠上皮免疫荧光染色图 (图2)。其中蓝色为核定位的DAPI信号标记了所有细胞的细胞核，绿色为内源表达的GFP标记了肠Enteroblast (EB) 细胞 (NRE，notch responsive element，特异性标记EB细胞)，白色膜定位信号 (Dl) 标记了肠干细胞，这两种细胞均为二倍体细胞 (小核DAPI)；多倍体 (大核DAPI) 细胞为肠吸收型细胞。


图2. 野生型雌性果蝇成虫肠上皮免疫荧光染色

注意事项

1. 果蝇肠道解剖完成之后要尽快进行固定，以确保信号的真实有效性，固定失败会导致信号弥散。
2. 过多的有机溶剂会一定程度上影响透膜进而影响抗原抗体的结合，对于较难通过杂交获取信号的抗体可用PBT多洗几遍有机溶剂固定及脱水后的肠道，必要时可省略甲醇脱水的步骤。
   

溶液配方

1. Grace’s Insect Medium 
   
   1)

   在900 ml ddH₂O中加入以下成分
   

   Schncider’s powdered medium	24.49 g
   NaHCO3	0.4 g
   CaCl2	0.6 g

   2)

   待完全溶解后用NaOH溶液调节pH至9.0 ± 0.2，然后用HCl调节pH至6.8 ± 0.2，用ddH₂O定容至1 L
   3)

   用直径为0.22 μm的滤器过滤除菌，分装后保存于4 °C冰箱
2. 10× PBS
   在900 ml ddH₂O中加入以下成分：

   NaCl	80 g
   KCl	2 g
   Na2HPO4	14.2 g
   KH2PO4	2.7 g

   定容至1 L，灭菌室温可保存半年
   
3. 1× PBS
   取100 ml 10× PBS稀释至1×，并调节pH至7.4，灭菌室温可保存半年
   
4. PBT
   在1× PBS中加入1‰的Triton X-100，充分混匀，灭菌室温可保存半年
   

致谢

本文所述实验方案参照自王晨辉博士的博士研究生毕业论文《Ras在果蝇APC突变所致肠道肿瘤进程的作用及Notch信号通路调节果蝇胃干细胞分化》中所述方法加以改进和优化。感谢郭兴庭博士提供图1B。

参考文献

1. 王晨辉. (2013). Ras在果蝇APC突变所致肠道肿瘤进程的作用及Notch信号通路调节果蝇胃干细胞分化. [博士论文]. 北京师范大学.