果蝇成蝇大脑的解剖与免疫组化

材料与试剂

1. 圆形贴纸 (AVERY, 1000 Labels White, 5720^TM)
2. 载玻片 (江帆牌, catalog number: 7105)
3. 盖玻片 (Electron Microscopy Sciences, catalog number: 72200-10)
4. 0.6 ml EP管 (Axygen, catalog number: MCT-060-C)
5. 培养皿 (北京瑞艾正特生物科技有限公司，一次性使用塑料培养皿)
6. 果蝇基因型为86E01-Gal4/UAS-GFP
7. Triton X-100 (Solarbio, catalog numbers: 9002-93-1 and T8200)
8. 封片液 (Vector, Vectashield Mounting Medium For Fluorescence, catalog number: ZD1002C)
9. 8%多聚甲醛 (Paraformaldehyde，PFA) (Electron Microscopy Science, catalog number: 157-8)
10. Normal Goat Serum (NGS) (Nordic-MUbio)
11. Mouse-anti-repo (Developmental Studies Hybridoma Bank, 8D12 anti-Repo-s)
12. Alexa Fluor^TM 555 goat anti-mouse IgG (Life technologies, catalog number: A21422)
13. 酒精 (山东利尔康医疗科技股份有限公司，利尔康^®75%酒精消毒液)
14. 指甲油 (品派, catalog number: 29269705379-E049)
15. 20× PBS缓冲液 (生工^®Sangon Biotech, catalog number: B548117-0500)
16. 0.3% PBST溶液 (见溶液配方)
17. 固定液 (4% PFA) (见溶液配方)
18. 封闭液 (5% NGS) (见溶液配方)
19. 一抗溶液 (见溶液配方)
20. 二抗溶液 (见溶液配方)
    

仪器设备

1. 镊子 (Dumostar, catalog number: 0209-5-PO)
2. 体视显微镜 (重庆奥特光学仪器有限公司，SMA-B4连续变倍体视显微镜)
3. 激光扫描共聚焦显微镜 (Nikon A1)
4. 摇床 (其林贝尔仪器制造有限公司, model: Transference Decoloring Shaker TS-8)
   

实验步骤

注：建议在避光条件下进行全部操作。

1. 果蝇冰上麻醉，在生理液中进行脑部的解剖 (图1)。
   
   
   图1. 果蝇成蝇头部示意图 (Wu和Luo，2006). A、C箭头所指处为眼球与口器的连接处，B箭头所指处为口器端部。蓝色虚线框内灰色阴影区域为果蝇成蝇大脑。
   
   
   1.1

   取3~6日龄的果蝇置于空管并放置于冰上2~3 min，使其处于低温昏迷状态。
   1.2

   滴一滴生理液于培养皿盖上，取一只已昏迷的雌蝇于该溶液中，在体视显微镜下剥离果蝇的头部：一个镊子钳住果蝇胸部，一个镊子夹在果蝇头胸部交界处并轻轻向外扯，即可使头部与身体分离。
   注：
   

   1)

   雌蝇个体普遍比雄蝇大，易于解剖。

   2)

   一个成蝇大脑的解剖建议在3 min内完成，不宜超过5 min，以保持大脑的正常形态及活性：若3 min内可完成，则生理液可提前置于冰上，解剖时不需在冰上进行；若速度过慢则建议直接在冰上进行大脑解剖。
   1.3

   用镊子分别夹住图1A、1B箭头所指向的位置，保持A处镊子夹紧不动，B处镊子向外扯，将果蝇的口器剖离。
   1.4

   用镊子分别夹住图1A、1C箭头所指向的位置，两个镊子夹紧后向相反方向移动拉扯，可使果蝇大脑从脑壳中完整被剖离。
   1.5

   刚被剖离出的脑子上布满白色细丝或薄膜状物体，为果蝇的气管及其他组织，用镊子轻轻剥离即可。干净的大脑呈现均匀半透明状 (图2)。
   
   
   图2. 果蝇成蝇大脑. D：背侧，V：腹侧，标尺为100 μm。
   
   
   
2. 取300 μl固定液 (4% PFA) 于600 μl洁净干燥的EP管并置于冰上，将已解剖的完整的成蝇大脑置于固定液中，每管大约放10~15个大脑。
3. 将EP管置于摇床上，25 rpm振荡，室温避光固定40 min。
   注：
   
   1)

   EP管放置方向应与摇床摇动方向相同，以保证大脑被充分固定和细胞膜打孔，便于抗体通透，接触到大脑深层的神经细胞等。
   2)

   此步骤中的上清溶液中含有多聚甲醛，对人体有害，应单独回收，集中处理。
4. 洗脱：两次快洗，一次慢洗。
   注：此步骤务必重复3次以洗去脑组织上的残留溶液。
   
   4.1

   快洗：取下EP管静置10 s左右，使大脑沉淀于管底，弃上清，加入200 μl 0.3% PBST溶液于管中，上下颠倒混匀，此步骤建议重复两次。
   4.2

   慢洗：取下EP管静置10 s左右，使大脑沉淀于管底，弃上清，加入300 μl 0.3% PBST溶液于管中，将EP管放入摇床，30 rpm振荡，室温避光慢洗30 min。
5. 取下EP管静置10 s左右，使大脑沉淀于管底，弃上清，加入400 μl封闭液 (5% NGS)，将EP管放入摇床，30 rpm振荡，室温避光封闭1~2 h。
6. 取下EP管静置10 s左右，使大脑沉淀于管底，弃上清，加入300 μl一抗溶液于管中，将EP管放入摇床，15 rpm振荡，4 °C避光孵育一抗过夜。 
7. 取下EP管静置10 s左右，使大脑沉淀于管底，一抗溶液回收，4 °C可保存1~2个月，可重复使用4~5次。
8. 重复快洗-慢洗操作三次，充分洗去一抗溶液。
9. 在避光条件下，取下EP管静置10 s左右，使大脑沉淀于管底，弃上清，加入300~400 μl二抗溶液，将EP管放入摇床，15 rpm振荡，4 °C避光孵育二抗过夜。 
10. 重复快洗-慢洗操作三次，充分洗去二抗溶液。
11. 取洁净干燥载玻片，贴圆形贴纸于载玻片中央，在磨砂处做好标记。
12. 从EP管中吸取2~5个成蝇大脑于载玻片圆形贴纸区域中央，沿贴纸边缘吸去多余液体，在体视显微镜下用镊子轻轻拨动脑子调整正反，并使它们位于同一个方向，便于后续显微镜观察记录。
    注：将显微镜灯光调至最暗，防止荧光猝灭。
    
13. 用10 μl量程移液枪轻轻移走大脑周围多余液体，迅速在圆形贴纸内加入5~7 μl封片液，使其没过脑组织，取盖玻片边缘倾斜45°靠近于封片液边缘，再缓缓放下，即将完全放下时，松开夹着盖玻片的镊子并迅速抽出，使盖玻片自然落下，可防止气泡产生。
    注：盖玻片提前用酒精浸泡，使用时用擦镜纸轻轻擦拭，放于干净纸上备用。
    
14. 蘸取适量透明指甲油，使指甲油刷上的液滴自然落下于载玻片边缘，移动指甲油刷使指甲油沿着载玻片边缘移动。
    注：
    
    1)

    注意指甲油用量：过多会浸入封片液中或将大脑遮盖，影响后续观察，过少则无法完成封片。
    2)

    切勿让指甲油刷触碰到盖玻片与载玻片，否则会造成盖玻片与载玻片之间的滑动，使大脑位置移动或产生气泡，影响后续结果观察。
15. 放置2 h使指甲油充分晾干，重复步骤14，完成封片，将玻片避光放入4 °C冰箱保存。
    注：4 °C可保存1~2周，建议在一周内完成显微成像，避免荧光信号猝灭影响实验结果。
    
16. 使用激光扫描共聚焦显微镜观察样品。
    注：务必确保指甲油已完全干透。
    

结果与分析

在神经系统中，神经细胞可分为神经元以及神经胶质细胞。其中神经胶质细胞发挥着重要的作用，例如，近年来，越来越多的证据表明神经胶质细胞与生物的昼夜节律息息相关 (Chi-Castaneda和Ortega，2018)。而在果蝇中，神经胶质细胞占据了神经系统中的10%，与多种行为的调控密切相关，例如节律、睡眠、学习记忆、运动、交配等，同时神经胶质细胞对于神经疾病以及行为障碍的研究起着重要作用，例如成瘾、共济失调、铁离子诱导的神经退行性疾病 (Zwarts等，2015)。那么鉴定特定神经细胞的细胞类型就显得尤为重要。本实验使用基因型为86E01-Gal4/UAS-GFP的果蝇，使用GFP标记86E01神经细胞 (即图3-GFP中绿色的细胞)，再进行免疫组化实验对86E01神经细胞进行细胞类型的鉴定。使用神经胶质细胞的常用标记物mouse-anti-repo对该果蝇大脑进行染色标记，图3-repo中的红色细胞即为神经胶质细胞，可以看出神经胶质细胞数量很多同时分布极为广泛。针对成蝇脑部嗅球区域进行细节分析 (图3-GFP、图3-Repo) 可鉴定出86E01神经细胞为神经胶质细胞，但86E01并不能表达出果蝇大脑中的所有神经胶质细胞。说明86E01可实现成蝇脑部部分神经胶质细胞的表达，但如果要实现特定脑区神经胶质细胞的表达，还需进一步改造基因，从而研究特定脑区神经胶质细胞的功能。


图3. 成蝇大脑的GFP遗传标记与免疫组化. 果蝇基因型为86E01-Gal4/UAS-GFP，使用mouse-anti-repo (红色) 对果蝇整个大脑进行免疫染色，GFP自带荧光 (绿色)，标尺为50 μm。图中虚线圈内为果蝇大脑嗅球区域 (AL, antennal lobe)。两小图为对成蝇脑部嗅球区域的细节放大图。

溶液配方

1. 0.3% PBST溶液
   0.6% Triton X-100水溶液与20× PBS缓冲液混合，调pH至7.4，4 °C保存
   
2. 固定液 (4% PFA)
   2× 0.3% PBST与8%多聚甲醛按照1:1的比例混合均匀，4 °C保存
   
3. 封闭液 (5% NGS)
   950 μl 0.3% PBST溶液加入50 μl NGS，现用现配，4 °C保存
   注：NGS溶液应避免反复冻融，在超净台严格无菌状态下进行分装操作。
4. 一抗溶液
   Mouse-anti-repo抗体按照1:200的比例使用5% NGS溶液稀释，4 °C保存
   
5. 二抗溶液
   Anti-mouse Alexa Fluor 555按照1:500比例使用5% NGS溶液稀释，4 °C避光保存
   注：免疫荧光多标色时，应选用动物种属差异较大的抗体，同时选用发射波长差异较大的荧光素作为标记物。

致谢

感谢国家自然科学基金 (31571089、31730045) 对本工作的支持；感谢陈彦博、郭靖对本实验的技术支持；感谢陈彦博提供的86E01-Gal4/UAS-GFP品系果蝇；本方法改编自2006年发表在Nature Protocol的A protocol for dissecting Drosophila melanogaster brains for live imaging or immunostaining (Wu等，2006)。

参考文献

1. 吕国蔚，李云庆. (2011). 神经生物学实验原理与技术. 科学出版社.
2. Chi-Castaneda, D. and Ortega, A. (2018). Glial cells in the genesis and regulation of circadian rhythms. Front Physiol 9: 88.
3. Kazama, H. (2015). Systems neuroscience in Drosophila: Conceptual and technical advantages. Neuroscience 296: 3-14.
4. Misteli, T. and Spector, D. L. (1997). Applications of the green fluorescent protein in cell biology and biotechnology. Nat Biotechnol 15(10): 961-964.
5. Sun, J., Liu, C., Bai, X., Li, X., Li, J., Zhang, Z., Zhang, Y., Guo, J. and Li, Y. (2017). Drosophila FIT is a protein-specific satiety hormone essential for feeding control. Nat Commun 8:14161.
6. Wu, J. S. and Luo, L. (2006). A protocol for dissecting Drosophila melanogaster brains for live imaging or immunostaining. Nat Protoc 1(4): 2110-2115.
7. Zwarts, L., Van Eijs, F. and Callaerts, P. (2015). Glia in Drosophila behavior. J Comp Physiol A Neuroethol Sens Neural Behav Physiol 201(9): 879-893.