摘要:果蝇的生殖干细胞是研究干细胞调控和微环境作用的重要模型。利用果蝇的生殖干细胞模型,人们首次证明了干细胞的微环境调控学说。而对于果蝇的生殖干细胞,免疫组织化学是主要的研究手段之一。利用抗原抗体的特异性结合特性,将特定蛋白用其特异性抗体 (IgG) 标记,并通过带有荧光基团的抗体结合已标记蛋白上的IgG,可以实现组织中特定蛋白质的标记,从而标记特定表达该蛋白的细胞并用于进一步分析。本文以雌性果蝇的卵巢为对象,通过抗α-Spectrin, Vasa两种抗体,标记原卵区 (germarium)的雌性生殖干细胞和其微环境,以便分析雌性生殖干细胞的干性维持和分化。
关键词: 果蝇, 雌性生殖干细胞, 原卵区, 微环境
材料与试剂
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移液枪头
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2 ml离心管
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载玻片
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盖玻片
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雌性成体果蝇
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指甲油
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37%甲醛 (formaldehyde, Sigma, catalog number: F1635)
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NaH2PO4
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Na2HPO4
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NaCl
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甘油
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DABCO (1,4-Diazabicyclo[2,2,2]octane)
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TritonTM X-100
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羊血清 (NGS)
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一抗 (特异性结合目标蛋白):大鼠抗Vasa (DSHB, anti-vasa),小鼠抗alpha-Spectrin (DSHB, 3A9)
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二抗 (带有荧光基团,特异性结合一抗):Alexa 568大鼠抗IgG (Molecular Probes),Alexa 488小鼠抗IgG (Molecular Probes)
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DAPI (4’,6’-diamidino-2-phenylindole; Sigma)
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磷酸缓冲液 (1× PBS, pH 7.4) (见溶液配方)
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PBT (1×) (见溶液配方)
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封片剂 (见溶液配方)
仪器设备
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镊子 (WPI®,Dumoxel合金镊子,#5 14098)
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移液器
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解剖板
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解剖显微镜 (Leica L2)
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摇床
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通风橱
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荧光显微镜 (Zeiss Meta 510)
实验步骤
一、 组织解剖和固定
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挑选较年轻的雌性成体果蝇,用二氧化碳麻醉。
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在多孔板中倒入PBS,在解剖显微镜下用镊子将卵巢从果蝇腹部取出,尽可能去除周围的脂肪,肠道等组织,加入带有500 μl PBS的2 ml离心管中。
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在通风橱中加入甲醛至甲醛4%的体积比,放置在摇床上,在室温下固定15分钟。
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使用移液器在通风橱中尽可能地吸去4%甲醛溶液。
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使用PBT洗去残留的甲醛溶液,洗三次,每次放置在摇床上5分钟。
二、 免疫组化染色
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吸去清洗的PBT,加入新300 μl PBT。
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加入羊血清至5%体积比,用于封闭。
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加入两种一抗,大鼠抗Vasa (1:200)、小鼠抗α-Spectrin (1:200) 放在放置在摇床上4 °C孵育过夜。
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使用移液器尽可能多的吸去一抗溶液,并用PBT洗去残留的溶液,洗三次,每次放置在摇床上5分钟。
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吸去清洗的PBT,加入新的300 μl PBT。
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加入两种二抗,Alexa568大鼠抗IgG (1:300)、Alexa488小鼠抗IgG (1:300) 放在摇床上常温避光孵育2小时。
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使用PBT洗去残留的二抗,加入新300 μl PBT,并加入1 μl DAPI染色,放置在摇床上,常温避光染色5分钟。
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使用PBT洗三次每次放置在摇床上5分钟。
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吸去清洗的PBT,加入30 μl封片剂,放入4 °C孵育半小时。
三、 制片与成像
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在解剖显微镜下放置一片载玻片。
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用移液器将卵巢和20 μl左右封片剂一起转移至载玻片上。
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在镜下用镊子剔去较大的卵细胞,留下卵巢前端,并将其轻轻分开,让卵巢小体 (ovariole) 分散在载玻片上。
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将盖玻片轻压在载玻片上,让封片剂填充满载玻片与盖玻片间空隙,再放上纸巾轻压,使得多余液体挤出并用纸巾吸干。如有液体不足,可用移液器补加适量封片剂,再重复步骤4。
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之后可以用指甲油密封盖玻片边缘,待指甲油晾干后,用荧光显微镜成像观察。
结果与分析
果蝇雌性生殖干细胞位于卵巢前部,原卵区的最前端,由它产生的子细胞经过一系列不完全分裂发育成16细胞的包囊细胞,并被卵泡细胞包裹成为卵室并出芽离开原卵区,在后续过程中其16个中的一个细胞发育为卵母细胞,其他细胞分化为滋养细胞合成卵黄成分,而滋养细胞本身也在之后分解凋亡,最终仅剩下一个卵细胞,形成成熟的卵。这一系列的生殖细胞系,均可通过Vasa蛋白的表达特异识别。通过对Vasa蛋白的免疫组织化学染色,可以明显观察到在原卵区的生殖细胞系的分化进程 (图1B)。并且DAPI能够将整个原卵区细胞的染色质染色 (图1A)。这使得我们通过将DAPI和Vasa的染色结果相结合 (图1A, 1B),观察到不属于生殖细胞的体细胞类群,而这些体细胞帮助构成了生殖干细胞干性维持和发育的微环境。
在原卵区里,果蝇雌性生殖干细胞收到微环境提供的Dpp信号调控,抑制生殖细胞分化所需的Bam基因表达,维持干细胞干性。而干细胞一旦离开提供Dpp信号的微环境,Bam基因的抑制解除,从而促使果蝇雌性生殖干细胞分化。而后续分化过程中,生殖细胞特征的细胞器结构spectrosome也会随之变化。生殖干细胞中的spectrosome常呈球形或棒状结构,细胞分裂后形成融合体 (fusome) 联通16细胞,帮助这其中的物质运输和卵母细胞形成 (Song等,2004)。而spectrosome中包含的α-Spectrin蛋白可以作为标记追踪spectrosome及之后的融合体的形态 (图1C),并帮助观察果蝇雌性生殖干细胞的后续分化过程 (Lin和Spradling,1995)。
除了正常免疫染色信号以外,免疫染色有时也会染上一些杂质,影响结果。在原卵区免疫染色中,有时会残留有附着原卵区的结构,例如鞘细胞。这些细胞很容易附着上抗体,造成假阳性的免疫荧光信号,需要注意区别,尽量选择特异性好的抗体。
图1. 果蝇卵巢原卵区免疫组化染色结果. A. DAPI染色细胞核;B. Vasa蛋白免疫组化染色,结合的是Alexa 488小鼠抗IgG;C. α-Spectrin蛋白免疫组化染色,结合的是Alexa568大鼠抗IgG;D. 各个通道染色结果叠加图像。
注意事项
一、荧光信号弱或无信号
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一抗与二抗不匹配
选用与一抗来源物种对应的二抗
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一抗或二抗浓度过低
适当增加抗体浓度
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抗体存储不当或污染导致失效
及时替换新抗体
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样品量过多
减少每管的样品量,每管尽量不超过5对卵巢
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样品在固定前放置时间过长
可以将解刨后组织浸泡在PBS中并插在冰上暂时保持一段时间 (不超过3小时) 至样品固定前
二、背景信号过强或非特异性识别
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一抗或二抗浓度过高
适当降低抗体浓度
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孵育一抗或二抗后,未洗净多余抗体
增加洗涤次数
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羊血清出现沉淀或变质,导致封闭效果不佳
换用新的羊血清
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制片后长时间未进行成像
制片后尽快进行成像,或者放到-20 °C保存
溶液配方
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磷酸缓冲液 (1× PBS, pH 7.4)
10 mM NaH2PO4/Na2HPO4
175 mM NaCl
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PBT (1×)
1× PBS
0.1% TritonTM X-100
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封片剂
70%甘油
2% DABCO
28% 1× PBS (v/v)
致谢
本文实验方案改编自发表文章Li等 (2010) 和 (2016)。
参考文献
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Li, X., Han, Y. and Xi, R. (2010). Polycomb group genes Psc and Su(z)2 restrict follicle stem cell self-renewal and extrusion by controlling canonical and noncanonical Wnt signaling. Genes Dev 24(9): 933-946.
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Li, X., Yang, F., Chen, H., Deng, B., Li, X. and Xi, R. (2016). Control of germline stem cell differentiation by Polycomb and Trithorax group genes in the niche microenvironment. Development 143(19): 3449-3458.
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Lin, H. and Spradling, A. C. (1995). Fusome asymmetry and oocyte determination in Drosophila. Dev Genet 16(1): 6-12.
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Song, X., Wong, M. D., Kawase, E., Xi, R., Ding, B. C., McCarthy, J. J. and Xie, T. (2004). Bmp signals from niche cells directly repress transcription of a differentiation-promoting gene, bag of marbles, in germline stem cells in the Drosophila ovary. Development 131(6): 1353-1364.
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