实验原理:在一定的温度和离子浓度下,使具有地高辛标记的特异序列RNA探针通过碱基互补规则与果蝇幼虫中枢神经组织中待测的RNA结合,之后通过探针上所标记的检测系统将待测RNA在果蝇幼虫中枢神经组织中的位置进行定位。
实验目的:检测某种特定RNA在果蝇幼虫中枢神经组织细胞中的表达分布情况。
关键词: RNA探针, 地高辛, 神经系统, 幼虫, 果蝇
材料与试剂
一、 实验器具
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一次性耗材
离心管50 ml, 10 ml, 1.5 ml
一次性枪头1,000 μl, 200 μl, 100 μl, 10 μl
封口膜或保鲜膜
小圆片 (Zweckform Verstaerkungsringe, catalog number: 3510)
指甲油
铝箔纸
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孵育器皿
1.5 ml离心管 (Axygen, catalog number: MCT-150-C)
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解剖器具
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玻片:20 mm × 40 mm,厚度小于20 μm
玻片首先用浓硫酸浸泡过夜,用大量去离子水清洗,再用RNase free水冲洗3遍,放在脱色架上,60 °C烘干,用锡箔纸包好,室温保存备用。使用时用玻璃刀从中间划分为两半,即20 mm × 20 mm的大小作为载玻片。同时用玻璃刀把20 mm × 40 mm的玻片平均分成3份,即20 mm × 13 mm大小的作为盖玻片
二、 溶液与试剂
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RNase AWAY (Invitrogen, catalog number: 7491543)
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Glycerol
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KCl
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Na2HPO4•12H2O
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KH2PO4
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NaOH
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多聚甲醛 (Paraformaldehyde) (北京益利精细化学品有限公司)
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Tween-20 (Sigma, catalog number: P1379)
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Triton X-100 (ICN Biomedicals, catalog number: 58404)
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Bovine serum albumin (BSA) (华美Sino-American Biotec BP 0042)
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FicollTM (华美Sino-American Biotec BIO 322)
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PVP (华美Sino-American Biotec BR 2205)
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NaCl (北京精细化工有限公司)
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柠檬酸钠 (北京精细化工有限公司)
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HCl
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Formamide (Amresco, catalog number: 1167B35)
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Torula RNA (Type IX) (Sigma, catalog number: R3629)
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Heparin (Sigma, catalog number: H3125)
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Sonicated salmon sperm DNA (Stratagene, catalog number: 201190)
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CHAPS (Sigma, catalog number: C3023)
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Levamisol, an inhibitor of endogenous phosphatase (Sigma, catalog number: L9756)
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DMF (Dimethylformamide, 二甲基甲酰胺) (防化学院化工厂)
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NBT (硝基四氮唑蓝) (Amresco, catalog number: E1181)
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BCIP (5-溴-4-氯-3-吲哚-磷酸) (Amresco, catalog number: E1041)
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EDTA (Amresco, catalog number: 0322, MW = 292.25)
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Tris (Amresco, catalog number: 0497, MW = 121.14)
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RNase A (BBI, catalog number: RB0473)
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封闭剂 (Blocking Reagent) (Roche, catalog number: 11096176001)
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Anti-Dig-AP抗体 (Roche, catalog number: 11093274910)
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甘油 (汕头市西陇化工有限公司)
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RNase free水 (见溶液配方)
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10× PBS (pH = 7.4) (见溶液配方)
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4%多聚甲醛 (见溶液配方)
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PTw (见溶液配方)
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PTX (见溶液配方)
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0.5 M EDTA (见溶液配方)
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1 M Tris (见溶液配方)
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50× Denhardt’s Solution (100 ml) (见溶液配方)
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20× SSC (pH = 7.0) (见溶液配方)
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杂交液 (whole mount hybridization buffer) (见溶液配方)
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RNase A储存液 (BBI, catalog number: RB0473) (见溶液配方)
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AP Buffer (Alkaline Phosphatase Buffer) (使用当天配) (见溶液配方)
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封闭剂 (Blocking Reagent) (见溶液配方)
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羊血清封闭液 (见溶液配方)
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Anti-Dig-AP抗体溶液 (见溶液配方)
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NBT/BCIP显色剂 (见溶液配方)
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甘油溶液 (见溶液配方)
注:所需溶液均须用RNase free水配制,提前配好并在15lbf/in2 (1,034 × 105 Pa) 高压下蒸气灭菌21 min。
仪器设备
注:所有玻璃器皿和金属用具进行无RNA酶处理。具体操作:洗净烘干后用锡箔纸封口,180 °C烘烤4小时。所有不能烘烤的器皿用大量RNase free水冲洗,然后用擦镜纸沾取RNase AWAY (Invitrogen) 擦拭。实验台面用纸巾沾取无水乙醇擦拭。
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玻璃器皿
量筒1,000 ml,100 ml,50 ml,25 ml,10 ml
烧杯1,000 ml,400 ml,250 ml,200 ml,100 ml,50 ml
细口瓶1,000 ml
称量 20 ml
玻璃棒
蓝口瓶
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镊子:DUMONT #5一把;DUMONT #55一把
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样品勺:是取果蝇脑样本的关键,一般用直径0.5 mm铂金丝制作而成 (普通的不锈钢和铜丝易生锈影响实验,而且这些材料质地不够细密,易粘果蝇的组织)
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MilliQ纯水仪 (Millipore)
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水浴锅 (电热恒温水箱) (北京市长风仪器仪表公司, model: HHW21)
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DHG恒温鼓风干燥箱 (山东德瑞克仪器有限公司)
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微量恒温器 (北京市方通达科技有限公司, model: TDW-1)
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全自动数显立式高压蒸汽灭菌器 (青岛胜方分析仪器有限公司, model: YXQ-LS-50SII)
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电子秤 (Acculab, model: ALC-11002) 及微量电子称 (Sartorius, model: CP124S)
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pH计 (Sartorius, model: PB-10)
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体式显微镜 (麦克奥迪, model: SMZ168,需要配20倍的目镜)
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冷光源 (北京福凯仪器有限公司, model: LGY-150)
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多道计时器
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Leica DM 2500显微镜
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移液器
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冰箱 (4 °C和-20 °C)
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加热器
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电磁炉
实验步骤
实验步骤参考Inagaki等,(2005);Li等,(2012和2014);Tautz和Pfeifle,(1989)。
第一天
一、 解剖和固定 (保持无RNA酶污染)
以做5管幼虫CNS原位杂交为例,第一天需要的溶液量:
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在预冷的1× PBS中解剖三龄幼虫CNS (如图1),用样品勺把解好的CNS转移固定液中。不必解剖的很干净,但不要带表皮,可以带mouthhook和discs。解剖一个固定一个,每个离心管中加入1 ml 4%多聚甲醛,离心管放在冰上。每个离心管中可放10个幼虫CNS。
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三龄幼虫CNS在4%多聚甲醛中4 °C过夜固定。
图1. 三龄幼虫CNS. Scale bar = 100微米。
第二天
二、 杂交 (保持无RNA酶污染)
以做5管幼虫CNS原位杂交为例,第二天需要的溶液量:
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用1 ml移液器吸掉4%多聚甲醛,加入1 ml PTw,室温静置10分钟。
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用1 ml移液器吸掉PTw,加入1 ml PTw,室温静置10分钟。重复该步骤3次。
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把杂交液在85~90 °C中加热5~7分钟,然后放在冰上快速冷却至少5分钟。
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用1 ml移液器吸掉PTw,加入0.2 ml PTw,再加入0.2 ml杂交液,轻弹管壁,混合均匀后,室温静置10分钟。
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用1 ml移液器吸掉PTw/杂交液,加入0.3 ml杂交液,60 °C水浴锅中预杂交至少1小时,最好4~5个小时。
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把探针液放入85~90 °C加热7分钟,然后放在冰上快速冷却至少5分钟。
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用200 μl移液器吸掉杂交液,加入0.2~0.3 ml探针液,用封口膜或保鲜膜把口封好,放入60 °C水浴锅中杂交过夜。
注:步骤6和8中的杂交液可以回收成为回收杂交液。
第三天
三、 洗涤和抗体孵育
以做5管幼虫CNS原位杂交为例,第二天需要的溶液量:
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回收探针液后,加入0.3 ml回收杂交液,60 °C水浴锅中10分钟。
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用1 ml移液器吸掉杂交液,加入0.3 ml回收杂交液,60 °C水浴锅中,10分钟。
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用1 ml移液器吸掉杂交液,加入0.3 ml 4:1杂交液:PTw,60 °C水浴锅中,20分钟。
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用1 ml移液器吸掉4:1杂交液:PTw,加入0.3 ml 3:2 杂交液:PTw,60 °C水浴锅中,20分钟。
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用1 ml移液器吸掉3:2杂交液:PTw,加入0.4 ml 2:3 杂交液:PTw,60 °C水浴锅中,20分钟。
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用1 ml移液器吸掉2:3杂交液:PTw,加入0.6 ml 1:4杂交液:PTw,60 °C水浴锅中20分钟。
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用1 ml移液器吸掉1:4杂交液:PTw,加入1 ml PTw,60 °C水浴锅中,20分钟。
注:步骤2~7中的杂交液应予以丢弃,不再回收使用。
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用1 ml移液器吸掉PTw,加入1 ml PTw,60 °C水浴锅中,20分钟。重复该步骤5次。
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用1 ml移液器吸掉PTw,加入1 ml 2× SSC,室温静置5分钟。
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用1 ml移液器吸掉2× SSC,加入1 ml 20 μg/ml RNase A溶液,在37 °C水浴锅中孵育10分钟。
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用1 ml移液器吸掉RNase A溶液,加入1 ml 2× SSC,室温静置5分钟。
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用1 ml移液器吸掉2× SSC,加入1 ml PTX,室温静置20分钟。
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用1 ml移液器吸掉PTX,加入1 ml PTX,室温静置20分钟。
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用1 ml移液器吸掉PTX,加入0.4 ml 0.5% block reagent (in PTX) 室温封闭至少1个小时。
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用1 ml移液器吸掉0.5% block reagent,加入0.4 ml 0.5% block reagent和10%羊血清室温封闭至少1个小时。
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用200 μl移液器吸掉0.5% block reagent和10%羊血清,加入0.2 ml提前在胚胎中孵育后的抗体孵育,4 °C过夜。
第四天
四、 洗涤和染色
PTX
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40 ml
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AP buffer
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12 ml (2 ml用来配染色剂)
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NBT/BCIP染色剂
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2 ml (2 ml AP buffer + 9 μl NBT + 7 μl BCIP)
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回收抗体,放在4 °C保存。加入1 ml PTX,室温静置5分钟。
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用1 ml移液器吸掉PTX,加入1 ml PTX,室温静置5分钟。
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用1 ml移液器吸掉PTX,加入1 ml PTX,室温静置30分钟。重复该步骤4次。
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用1 ml移液器吸掉PTX,加入1 ml RNase free水,室温静置3分钟。
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用1 ml移液器吸掉RNase free水,加入1 ml AP buffer,室温静置5分钟。
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用1 ml移液器吸掉AP buffer,加入1 mlAP buffer,室温静置5分钟。
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用1 ml移液器吸掉AP buffer,加入0.4 ml NBT/BCIP染色剂避光染色。
此时需注意观察,如果染色剂变色 (浅紫),可以换掉加入新鲜的染色剂。如希望染色慢些,可以放入4 °C。染色时间由于探针的不同而不同,有些探针10分钟就有信号,有些探针染色时间则长达3天。
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染色完成后,用200 μl移液器吸掉染色剂,加入1 ml去离子水洗1次,室温静置3分钟。
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用1 ml移液器吸掉去离子水,加入1 ml PTX,室温静置10分钟。
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用1 ml移液器吸掉PTX,加入1 ml PTX,室温静置1小时。重复该步骤3~5次。这个过程中可以继续解剖染色后的样品,去掉CNS上其他的附着物。
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用1 ml移液器吸掉PTX,加入0.4 ml 50% glycerol,几个小时后等样品沉底。
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用1 ml移液器吸掉50% glycerol,加入0.4 ml 70% glycerol,此时的样品可以封片拍照也可以放入-20 °C保存。
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封片:将两片小圆片 (Zweckform Verstaerkungsringe) 重叠后,贴在载玻片上,加入7 μl 70% glycerol,用样品勺依次把3~5个样品放入,用镊子夹着一根头发丝,在显微镜下把样品的位置摆正后,在小圆片周围涂上指甲油,不能太多和太少,和小圆片等高即可。用镊子将切好尺寸的盖玻片盖上。并在玻片上记下探针名称,果蝇品系,封片时间。
溶液配方
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RNase free水
使用高温烘烤后的细口瓶,接取纯水仪处理后的超纯水,用铝箔纸将瓶口裹紧,在15lbf/in2 (1,034 × 105 Pa) 高压下蒸气灭菌21 min,冷却至室温后使用
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10× PBS (pH = 7.4)
用RNase free水稀释10× PBS配制成1× PBS
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4%多聚甲醛
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1× PBS + 0.1% Tween-20 (使用当天配)
以配制1,000 ml PTw为例:
用1,000 ml量筒量取1,000 ml 1× PBS,加入1 ml Tween-20,充分混匀
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PTX
1× PBS + 0.3% Triton X-100 (使用当天配)
以配制1,000 ml PTX为例:
用1,000 ml量筒量取1,000 ml 1× PBS,加入3 ml Triton X-100,充分混匀
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0.5 M EDTA
以配制100 ml 0.5 M EDTA溶液为例:
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1 M Tris
1 M Tris溶液分为三种,分别为pH = 7.5、pH = 7.8、pH = 9.5
以配制100 ml 1 M Tris (pH = 9.5) 溶液为例:
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50× Denhardt’s Solution (100 ml)
1 g 1% (w/v) Bovine serum albumin (BSA)
1 g 1% (w/v) FicollTM
1 g 1% (w/v) PVP
用RNase free水定容至100 ml,分装为1 ml/管,-20 °C保存
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20× SSC (pH = 7.0) (1 L)
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提供两个配方供参考,在与RNA探针杂交实验中使用配方1,因为其中含有的封闭成分比较多,有利于降低杂交的背景。但在杂交后的洗涤中使用不含sperm DNA的配方2,因为洗涤的要求不高,使用成分少的杂交液可以降低实验成本。溶液配好后放在-20 °C保存
杂交液配方1
杂交液配方2
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RNase A储存液
一般配制成10 mg/ml的储液。以配制10 ml为例:
使用时吸取20 μl加入到中10 ml 2× SSC,混匀后就是20 μg/ml RNase A溶液
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AP Buffer (Alkaline Phosphatase Buffer) (使用当天配)
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封闭剂 (Blocking Reagent)
一般配成10%储存液。以配制50 ml储存液为例:
20 ml幼虫CNS用0.5% block reagent:
19 ml 1x PTX
1 ml 10% block reagent
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羊血清封闭液
封闭用正常羊血清原液
灭活:
20 ml幼虫CNS用0.5% block reagent和10%羊血清封闭液:
17 ml 1× PTX
1 ml 10% block reagent
2 ml羊血清
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Anti-Dig-AP抗体
幼虫CNS用抗体的准备
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NBT/BCIP显色剂
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甘油
致谢
该文章得到国家自然科学基金 (31571033,91632107) 和中国科学院前沿重点研究计划 (QYZDY-SSW-SMC015) 的资助;该实验方案改编自中国科学院生物物理研究所温省云博士毕业论文 (2012);使用该实验方案发表的文章:Li等 (2012和2014)。
参考文献
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李美霞,温省云,许孟博,崔名扬,刘力. (2019). 果蝇胚胎原位杂交实验方案. Bio-101 e1010246. Doi: 10.21769/BioProtoc.1010246.
-
Inagaki, S., Numata, K., Kondo, T., Tomita, M., Yasuda, K., Kanai, A. and Kageyama, Y. (2005). Identification and expression analysis of putative mRNA-like non-coding RNA in Drosophila. Genes Cells 10(12): 1163-1173.
-
Li, M., Wen, S., Guo, X., Bai, B., Gong, Z., Liu, X., Wang, Y., Zhou, Y., Chen, X., Liu, L. and Chen, R. (2012). The novel long non-coding RNA CRG regulates Drosophila locomotor behavior. Nucleic Acids Res 40(22): 11714-11727.
-
Li, M., Xu, M., Wen, S., Bai, B., Chen, R. and Liu, L. (2014). One novel long noncoding RNA lnc10 in Drosophila. J Genet Genomics 41(2): 79-82.
-
Tautz, D. and Pfeifle, C. (1989). A non-radioactive in situ hybridization method for the localization of specific RNAs in Drosophila embryos reveals translational control of the segmentation gene hunchback. Chromosoma 98(2): 81-85.
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Copyright: © 2019 The Authors; exclusive licensee Bio-protocol LLC.
引用格式:李美霞 , 温省云, 许孟博, 崔名扬, 刘力. (2019). 果蝇幼虫CNS原位杂交实验方案.
Bio-101: e1010247. DOI:
10.21769/BioProtoc.1010247.
How to cite: Li, M. X., Wen, S. Y., Xu, M. B., Cui, M. Y. and Liu, L. (2019).
In situ Hybridization in CNS of
Drosophila Larvae.
Bio-101: e1010247. DOI:
10.21769/BioProtoc.1010247.