草莓细胞壁物质测定

材料与试剂

1. 草莓
2. 乙醇
3. Tris酚 (华佰泰生物)
4. 氯仿 (北京化工)
5. 甲醇 (北京化工)
6. 丙酮 (北京化工)
7. KOH
8. NaBH₄
9. Tris
   
10. HCl
    
11. CDTA
12. α-淀粉酶
13. 四硼酸钠
14. 浓硫酸 (北京化工) 
15. NaOH
16. D-半乳糖醛酸 (标样)
17. 葡萄糖 (标样)
18. 50 mM 乙酸溶液 pH 6.5
19. 4%KOH (0.1%NaBH₄)
20. 0.1 M Tris-HCl (pH 7.0)
21. 0.15%间羟基联苯 (用0.5%的NaOH溶解)
22. 50 mM CDTA-乙酸钠 (见溶液配方)
23. 50 mM 碳酸钠 (2 mM CDTA) 溶液(见溶液配方)
24. 0.48%四硼酸钠-硫酸 (见溶液配方)
25. 蒽酮-硫酸 (见溶液配方)
    

仪器设备

1. 移液器
2. 研磨器具
3. 34 °C烘箱
4. 离心机
5. 4 °C冰箱
6. 透析袋 (留存分子量3,500，购自Biotopped，美国)
   

实验步骤

1. 细胞壁干物质的提取
   参照Brummell et al. (2004) 的方法。取果肉10 g，研磨后加入50 ml 80%的乙醇溶液混匀后过滤，收集沉淀，向沉淀中加入100 ml 80%的乙醇溶液，并混匀。过滤，沉淀加入40 ml Tris酚 (pH 7.0)，混匀之后在室温下放置30 min。(再加入100 ml 80%乙醇，放入-20 °C反应1 h，过滤，再用100 ml 95%乙醇洗一遍-可省略) 过滤，沉淀加入100 ml 氯仿:甲醇 (1:1) 溶液反应30 min室温，混匀之后过滤，沉淀加入100 ml 丙酮溶液洗涤，过滤得到沉淀，将沉淀放在34 °C烘箱中12 h，得到细胞壁干物质。称并记录干物质质量。
   注：该过程需要大量有机试剂，气味重，且有一定毒性，建议戴口罩，在通风橱进行试验。
2. 果胶和纤维素的提取
   
   1)

   参考Rose et al. (1998) 的方法。取干物质100 mg，加入20 ml 50 mM的乙酸溶液 (pH 6.5)，室温下反应24 h，离心得到上清液，取1 ml定容至10 ml即为水溶性果胶。
   2)

   在剩余沉淀加入20 ml 的 50 mM CDTA-乙酸钠 (pH 6.5) (见溶液配方1)，室温下反应24 h，离心10,000 x g 15 min，上清液定容至25 ml，取1 ml进行透析24 h，将透析液定容至5 ml，得到即为离子型果胶。
   注：透析前，检测透析袋是否漏水；透析袋呈管状，透析前先用夹子封好一侧，在加完透析液后将另一侧封好，用挂牌做好标记，放进纯水中透析，最好用磁力搅拌器加速透析，最好每隔2 h换一次水，使透析充分。
   3)

   在剩余沉淀加入20 ml 的 50 mM 的碳酸钠 (2 mM CDTA) 溶液 (见溶液配方2)，4 °C反应24 h (4 °C 18 h，室温2 h)，离心，(上清液在冰上用乙酸进行中和，之后定容至50 ml，取1 ml透析24 h) 透析得到共价性果胶。
   4)

   在剩余沉淀加入20 ml 4%KOH (0.1% NaBH₄)，室温下反应48 h，离心上清液加入2倍体积的无水乙醇在4 °C中过夜沉淀，之后离心弃掉上清液，沉淀加入10 ml 0.1 M Tris-HCl (pH 7.0) 含30个单位的α-淀粉酶，室温下反应24 h，取1 mL透析得到的溶液即为易溶性半纤维素。
   注：α-淀粉酶要现用现配。
   5)

   在剩余沉淀加入20 ml 24%KOH，室温下反应48 h，离心上清液加入2倍体积的无水乙醇在4 °C中过夜沉淀，之后离心弃掉上清液，沉淀加入10 ml 0.1 M Tris-HCl (pH 7.0) 含30个单位的α-淀粉酶，室温下反应24 h，取1 ml透析得到的溶液即为难溶性半纤维素。
   注：α-淀粉酶要现用现配。
   6)

   最后剩余沉淀用去离子水洗2遍，65 °C烘箱烘干即为纤维素。
   注：沉淀要充分洗净，否则干燥后易出现盐结晶。
3. 果胶和纤维素的测定
   1)

   参照Blumenkrantz and Asboe-Hansen (1973) 的方法，取1 ml 的提取液加入6 ml 的0.48%四硼酸钠-硫酸溶液 (见溶液配方3) 混匀，煮沸10 min ，冷却至室温后加入100 μl 0.15%间羟基联苯 (用0.5%的NaOH溶解) 溶液，对照样品加入100 μl 0.5%NaOH溶液，立即混匀，室温放置40 min，在波长520 nm处测定吸光度。用1 ml的去离子水用上述方法操作得到空白对照调零。以D-半乳糖醛酸做标准曲线，结果以mg/g表示。
   注：在样品中加入四硼酸钠-硫酸溶液后，盖紧试管塞，上下摇晃混匀；操作浓硫酸时注意安全。
   2)

   用蒽酮硫酸法测定半纤维素含量。取2 ml提取液加入5 ml蒽酮-硫酸 (见溶液配方4)，混匀后在沸水中煮沸10 min，冷却至室温后在波长620 nm处测定吸光度，用2 ml去离子水用上述方法操作得到空白对照调零。以葡萄糖做标准曲线，结果以mg/g表示。
   注：在样品中加入蒽酮-硫酸后，盖紧试管塞，上下摇晃混匀；操作浓硫酸时注意安全。
   

结果与分析

1. 在520.0 nm下，不同处理后草莓果实吸光值由标准曲线转化后的数据 (表1)
   
   表1. 不同处理草莓果实水溶型果胶含量
   
   

溶液配方

1. 50 mM CDTA-乙酸钠
   50 mM CDTA，用乙酸钠溶解并定容
2. 50 mM 碳酸钠 (2 mM CDTA) 溶液
   50 mM 碳酸钠，加入母液CDTA至终浓度为2 mM
3. 0.48%四硼酸钠-硫酸
   

   2.4 g	四硼酸钠
   500 ml	硫酸

4. 蒽酮-硫酸 
   

   0.25 g	蒽酮
   100 ml	浓硫酸

致谢

感谢国家自然基金 (31370323) 的支持。

参考文献

1. Blumenkrantz, N. and Asboe-Hansen, G. (1973). New method for quantitative determination of uronic acids. Anal Biochem 54(2): 484-489.
2. Brummell, D. A., Dal Cin, V., Crisosto, C. H. and Labavitch, J. M. (2004). Cell wall metabolism during maturation, ripening and senescence of peach fruit. J Exp Bot 55(405): 2029-2039.
3. Rose, J. K., Hadfield, K. A., Labavitch, J. M. and Bennett, A. B. (1998). Temporal sequence of cell wall disassembly in rapidly ripening melon fruit. Plant Physiol 117(2): 345-361.