柑橘汁胞中呋喃香豆素单体的提取及UPLC检测

材料与试剂

1. 离心管 (50 ml、10 ml)
   
2. 一次性注射器
   
3. 0.22 μm微孔滤膜
   
4. 柑橘成熟果实
   
5. 液氮
   
6. 乙腈：色谱级 (Fisher Scientific, USA)
   
7. 香柠檬亭，佛手苷，6',7'-二羟基香柠檬亭标准品：色谱级 (Sigma-Aldrich, USA)
   
8. 环氧香柠檬亭标准品：色谱级 (Chromdex, USA)
   
9. 乙酸乙酯：分析纯 (国药集团化学试剂有限公司，北京)
   
10. 超纯水
    

仪器设备

1. 研钵
   
2. 天平
   
3. 洁盟JP-100S超声波萃取仪 (洁盟，中国)
   
4. Avanti J-20 XP型离心机 (Beckman Counter, USA)
   
5. 5301型旋转蒸发仪 (Eppendorf, German)
   
6. Waters PRO PLUS型超纯水制备仪 (Labconco, USA)
   
7. Waters 超高效液相色谱 (UPLC)：二极管阵列检测器 (Photodiode Array Detector, PDA)，C18色谱柱 (规格为2.1 x 50 mm，粒径1.7 μm) (WATERS, USA)

实验步骤

1. 分离取出柑橘成熟果实汁胞，用液氮在研钵中磨成粉状。
   
2. 准确称量5 g粉状物，加入到50 ml的离心管中，加入15 ml提取试剂乙酸乙酯。
   
3. 充分振荡5 min，将离心管置于超声波萃取仪中萃取30 min。
   
4. 将离心管置于离心机中，转速为3,913 x g，离心5 min，收集上层有机相于新的离心管中。
   
5. 向50 ml离心管的残留物再加入10 ml乙酸乙酯，重复步骤3-4一次。
   
6. 重复步骤5一次。
   
7. 将收集的有机相分装到10 ml离心管中，通过旋转蒸发仪在30 °C条件下蒸干浓缩，用乙腈定容至1 ml，用一次性注射器吸取上清经0.22 µm微孔滤膜过滤后进行UPLC检测。
   
8. UPLC检测色谱条件：流动相A相乙腈溶液，B相超纯水，梯度洗脱条件见表1；流速0.4 ml/min；检测波长310 nm；进样量2 µl；样品室温度20 °C；色谱柱温度30 °C。
   
   表1. 呋喃香豆素单体物质梯度洗脱方法
   
   

结果与分析

4种呋喃香豆素单体标准品和梦能早柚的UPLC色谱图见图1。


图1. 四种呋喃香豆素单体标准品 (A) 和梦能早柚 (B) 的UPLC色谱图. RT指保留时间；1为佛手苷；2为6',7'-二羟基香柠檬亭；3为环氧香柠檬亭；4为香柠檬亭。

致谢

该实验方案改编自先前发表的文章Xu et al. (2015).

参考文献

1. Xu, J., Ma, L., Jiang, D., Zhu, S., Yan, F., Xie, Y., Xie, Z., Guo, W. and Deng, X. (2015). Content evaluation of 4 furanocoumarin monomers in various citrus germplasms. Food Chem 187: 75-81.
   
2. Widmer, W. and Haun, C. (2010). Variation in furanocoumarin content and new furanocoumarin dimers in commercial grapefruit (Citrus paradisi Macf.) juices. Journal of Food Science 70(4): C307-C312.