实验原理：聚丙烯酰胺凝胶具有分子筛效应，且分辨率极高。聚丙烯酰胺凝胶电泳(Polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE)可以区分所扩增SSR片段间的差异，通过银染显色可以确认核酸中特异SSR的多态性。
实验目的：分析柑橘中SSR位点的多态性。
关键词: 柑橘, SSR分子标记, PAGE, 银染
材料与试剂
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丙烯酰胺
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N,N-甲叉双丙烯酰胺
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脲
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Tris-Base
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硼酸
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EDTA (乙二胺四乙酸二钠)
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过硫酸铵(APS)
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TEMED (四甲基乙二胺)
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冰醋酸
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95%乙醇
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反硅化剂 (3-(Trimethoxysilyl)propyl methacrylate) (4 °C保存)
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硅化剂 (Acryl-Glide)
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硝酸银
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无水碳酸钠
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氢氧化钠
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甲醛溶液
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二甲苯青
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溴酚蓝
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甲酰胺
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用于检测的PCR产物
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5x TBE (见溶液配方)
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丙烯酰胺母液(见溶液配方)
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10% APS (见溶液配方)
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反硅化液 (见溶液配方)
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银染液 (见溶液配方)
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显色液 (见溶液配方)
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上样缓冲液 (见溶液配方)
仪器设备
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电泳仪
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制胶用的长、短玻璃板，塑料边条
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电泳梳子
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涡旋仪
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移液器
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燕尾夹
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PCR仪
实验步骤
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用自来水将长、短玻璃板分别洗干净，晾干水分后，用纸巾沾取95%乙醇擦洗两遍，在长玻璃板上均匀涂抹约1.5 ml的反硅化液，在短玻璃板上均匀涂抹4-5滴的硅化剂，晾干后使用。
注：清洗长、短玻璃板使用不同的清洁棉，以免影响硅化液与反硅化剂的效果；涂抹短玻璃板时因反硅化剂量较少，可先用95%乙醇湿润纸巾后涂抹。
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将塑料边条洗净后放置于长玻璃板两侧边缘，然后将短玻璃板小心扣于长玻璃板上，对齐后使用3对燕尾夹将玻璃板固定，对称地夹在放有塑料边条处。
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取50 ml丙烯酰胺凝胶母液，加入250 μl 10%的APS和25 μl TEMED，混匀后配成工作液。
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将工作液倒入长、短玻璃板中间的隔缝里，然后将梳子平滑的一面插入短玻璃板的凹槽处，聚合1-1.5 h后即可进行电泳。
注：此步骤操作时容易产生气泡，应均匀倒工作液，如果产生气泡须及时除去。
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小心取出梳子，将梳子清洗干净备用，同时将玻璃板外部及短玻璃板凹槽处的碎胶清洗干净，也可用滤纸进行清除。
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上、下电泳槽分别加入约500 ml和400 ml的0.5倍TBE电泳液，以80 W的功率预电泳20-30 min，用1 ml移液器将点样槽中的杂质冲洗掉，插上梳子。
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预电泳时可将PCR产物进行变性处理，即在产物中加入上样缓冲液 (一般10 μl产物中加入5 μl的上样缓冲液)，95°C变性5 min后冰浴3-5 min，上样量为3.0-3.5 μl，以80 W的功率电泳约1 h，即二甲苯青示踪条带距底部1/4处即可停止电泳。
注：变性后的产物不能存放太久，上样前再进行变性。
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分离两块玻璃板，用双蒸水漂洗长玻璃板1次，取出后稍沥水，置于银染液中10-12 min。
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从银染液中取出玻璃板，在双蒸水中迅速漂洗一遍 (不超过10 s)，取出后置于显色液中，直至条带清晰，取出后用双蒸水漂洗1-2 min。
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晾干玻璃板，拍照保存后读取条带进行相应分析 (如图1)。
图1. 柑橘中SSR的PAGE结果示例
溶液配方
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5x TBE
Tris-Base
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108 g
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硼酸
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55 g
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0.5 M-EDTA(pH 8.0-8.5)
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40 ml
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ddH2O
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to 2 L
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丙烯酰胺母液(过滤后于4°C保存)
丙烯酰胺
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114 g
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N,N-甲叉双丙烯酰胺
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6 g
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脲
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840 g
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5x TBE
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200 ml
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ddH2O
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to 2 L
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10% APS(4°C保存，可使用一周)
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反硅化液
0.5%冰醋酸+95%乙醇
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1.5 ml
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反硅化剂(3-(Trimethoxysilyl)propyl methacrylate)
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3.5 μl
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银染液
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显色液(使用不超过6次)
无水碳酸钠
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1 g
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氢氧化钠
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33.3 g
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甲醛溶液
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10 ml
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ddH2O
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to 2 L
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上样缓冲液
二甲苯青
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0.1 g
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溴酚蓝
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0.1 g
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0.5 M-EDTA (pH 8.0-8.5)
|
1 ml
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甲酰胺
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100 ml
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