高纯度柑橘基因组DNA提取与检测

材料与试剂

1. 50 ml BECKMAN离心管
   
2. 10 ml离心管
   
3. 各种型号的枪头 (5 ml，1 ml，200 μl，20 μl)
4. 组织样品 (叶片愈，愈伤组织，果肉)
   
5. 液氮
6. CTAB (DNA提取缓冲液)
   
7. β-巯基乙醇
   
8. 氯仿 (三氯甲烷)
   
9. 异戍醇
   
10. 异丙醇
    
11. Tris
    
12. EDTA-Na₂
    
13. NaCl
    
14. RNase A (Thermo Fisher Scientific, catalog number: EN0531,10 mg/ml)
    
15. Tris-饱和酚
    
16. NH₄Ac
    
17. 1 M Tris-HCl (pH 8.0) (见溶液配方)
    
18. 0.5 M EDTA (pH 8.0) (见溶液配方)
    
19. 5.0 M NaCl (见溶液配方)
    
20. 苯酚:氯仿:异戊醇 (25:24:1) (见溶液配方)
    
21. CTAB buffer (见溶液配方)
    
22. 氯仿:异戍醇 (24:1) (见溶液配方)
    
23. 76%无水乙醇 (见溶液配方)
    
24. TE缓冲液 (见溶液配方)
    
25. 水饱和乙醚 (见溶液配方)
    
26. 70%乙醇 (见溶液配方)

仪器设备

1. 研钵
   
2. 离心管架 (50 ml，10 ml)
   
3. 恒温水浴锅 (常州润华电器有限公司)
   
4. 各种规格的移液器
   
5. 离心机 (配备50 ml、10 ml转头，转速大于4,000 x g)
   
6. -20 °C冰箱
   
7. Nanodrop 1000微量紫外分光光度计
   
8. 电泳仪 (北京六一仪器厂)
9. 凝胶成像系统
   
10. 磁力搅拌器
    

实验步骤

1. 取2-5 g组织样品 (一般叶片取2 g，愈伤组织取3 g，果肉取4 g)，加入适量液氮充分研碎，转入预冷的50 ml离心管，加入20 ml DNA提取缓冲液充分摇匀，于65 °C水浴60-90 min，水浴过程中每隔15 min轻轻摇匀一次。
   
2. 加入15 ml氯仿:异戍醇 (24:1) 轻轻摇匀10 min，4,000 x g离心15 min。
   
3. 取上清液转移到另一50 ml离心管加入10 ml氯仿:异戍醇 (24:1) 重复步骤2。
   
4. 取上清液转移到另一干净的50 ml离心管，加入15 ml冷冻 (-20 °C) 的异丙醇，轻轻摇匀后于-20 °C冷冻半小时，4,000 x g离心10 min。弃上清液，加入5 ml 76%的乙醇浸泡5 h (或过夜)，中途换76%的乙醇2-3次。
5. 弃乙醇风干沉淀约半小时，加入3.0 ml TE缓冲液溶解沉淀，加入20 µl RNase A，轻轻摇匀，37 °C温浴3 h (或过夜)，中途轻轻摇匀3-5次。
   
6. 将溶液转入10 ml离心管中，加入3.0 ml苯酚:氯仿:异戊醇 (25:24:1) (用下层有机相) 充分颠倒混匀10 min，4,000 x g离心15 min，吸上清液于另一10 ml的离心管中。(此步骤可酌情重复一次)
   
7. 加入1 ml 5.0 M的NaCl和3.0 ml水饱和乙醚 (用上层有机相)，轻摇充分混匀10 min，4,000 x g离心5 min。
   
8. 用移液器吸出上层乙醚弃掉，用1 ml枪头挡住离心管管口内侧，用力下压枪头，使枪头与管壁间形成一狭缝，堵住中间层胶状物，让下清液从缝中流入另一10 ml离心管。
   
9. 加入5 ml冷冻 (-20 °C) 的异丙醇，轻轻摇匀后于-20 °C冰箱冷冻半小时，4,000 x g离心10 min。弃上清液，加入3 ml 70%的乙醇浸泡4-6 h (或过夜)，中途换70%乙醇2-3次。风干乙醇，加入100 µl TE溶解DNA。
   
10. 取DNA原液1 µl用NanoDrop1000测定230 nm、260 nm及280 nm的吸光值及DNA浓度。
    注：高质量的DNA要求：A₂₆₀/A₂₃₀ > 2.0；1.7 < A₂₆₀/A₂₈₀ < 1.9。
    
11. 根据DNA浓度取1 μg DNA原液稀释至5 μl后，用1x TAE，1.2%琼脂糖凝胶5 V/cm电泳20 min，凝胶成像仪拍照保存。高质量的DNA呈现大于10 kb的单一条带，点样孔干净无污染、泳道无拖带。
    

注意事项

1. 提取过程使用的离心管、枪头都要灭菌 (121 °C，15 min) 烘干备用。
   
2. DNA是大分子长片段，整个提取过程动作要轻柔，防止DNA分子断裂降解。
   
3. 需要大量高质量基因组DNA时，用新鲜的成熟叶片提取DNA较好，幼嫩叶片果胶含量较高，不利于纯化。
   

溶液配方

1. 1 M Tris-HCl (pH 8.0)
   称取Tris-Base 121 g，加入约800 ml水在磁力搅拌器上搅拌，使其充分溶解后加入浓盐酸调pH至8.0后加水定溶至1,000 ml，灭菌 (121 °C，15 min) 后于室温保存
   
2. 0.5 M EDTA (pH 8.0)
   称取EDTA-Na₂盐187 g加入约800 ml水，在磁力搅拌器上边搅拌边加入固体NaOH，当EDTA和NaOH均完全溶解，溶液变清时其pH值刚好达到8.0左右，再用pH试纸略加调整即可，灭菌 (121 °C，15 min) 后于室温保存
   
3. 5.0 M NaCl
   称取NaCl 300 g，加入蒸馏水约800 ml于磁力搅拌器上充分搅拌，约5分钟后停止搅拌，静止2-3分钟，倒出上清液，再加入100 ml蒸馏水重复前面的步骤，直到NaCl充分溶解后定溶至1,000 ml，灭菌 (121 °C，15 min) 后于室温保存
   
4. CTAB buffer
   DNA Buffer (1,000 ml)
   
   灭菌后于室温下保存3个月左右，使用时取适量Buffer按2%比例 (每100 ml Buffer加入2 g CTAB) 加入CTAB，65 °C水浴锅中充分溶解；在通风橱里加入1%的巯基乙醇 (现配现用)
   
5. 氯仿:异戍醇 (24:1)
   500 ml氯仿中加入21 ml异戊醇，混匀，棕色瓶中常温保存
6. 76%无水乙醇
   380 ml无水乙醇中加入120 ml双蒸水，再加入0.385 g NH₄Ac，混匀
   
7. TE缓冲液 (100 ml)
   
   
8. 酚:氯仿:异戍醇 (25:24:1)
   Tris-饱和酚与氯仿:异戍醇 (24:1) 以1:1的比例等体积混合，棕色瓶中4 °C冰箱保存，使用时取下层
   
9. 水饱和乙醚
   无水乙醚与双蒸水等体积混匀，静置分层，上层为水饱和乙醚
   
10. 70%乙醇
    350 ml无水乙醇与150 ml双蒸水混匀
    

参考文献

1. Cheng, Y., Yi, H., Pang, X., Guo, W. and Deng, X. (2001). An efficient method for genomic DNA extraction from woody fruit plants. J Huazhong Agric Univ 20 (5): 481-483. (in Chinese)