农杆菌介导柑橘上胚轴稳定转化

材料与试剂

1. 滤纸
   
2. 封口胶
   
3. 橡皮筋
   
4. 柑橘种子
   
5. 75%酒精
   
6. 次氯酸钠
   
7. NaOH
   
8. 蒸馏水
   
9. 农杆菌菌株EHA105 (携带含目的基因载体)
   
10. 6-Benzylaminopurine (6-BA) 
    
11. Kinetin (KT) 
    
12. Naphthalene acetic acid (NAA)
    
13. Indole-3-acetic acid (IAA) 
    
14. Kanamycin (Kan)
    
15. Dimethyl Sulfoxide (DMSO)
    
16. Acetosringone (AS) 
    
17. Cephalosporins (Cef)
    
18. 培养基母液 (详见柑橘组织培养常用培养基配制方法 [杨雯惠等，2018])
    1)

    肌醇储备液 (100x) 
    
    2)

    甘氨酸储备液 (100x) 
    
    3)

    微量储备液 (100x)
    
    4)

    大量储备液 (100x) 
    
    5)

    铁盐储备液 (100x) 
    
    6)

    Vitamin储备液 (100x)
    
19. 激素类试剂母液 (见柑橘原生质体融合-电融合 [刘丹等，2018])
    1)

    6-BA储备液 (1 mg/ml)
    
    2)

    KT储备液 (1 mg/ml)
    
    3)

    IAA储备液 (1 mg/ml) 
    
    4)

    NAA储备液 (1 mg/ml)
    
20. 培养基 (详见柑橘组织培养常用培养基配制方法 [杨雯惠等，2018])
    1)

    MT基本培养基
    
    2)

    MT播种培养基
    
    3)

    生芽培养基 
    
    4)

    MT悬浮培养基 
    
    5)

    生根培养基 
    
    6)

    LB培养基
    
21. 50 mg/ml AS储备液 (见溶液配方)
    
22. 400 mg/ml Cef储备液 (见溶液配方)
    
23. 50 mg/ml Kan储备液 (见溶液配方)
    
24. 共培养基 (见溶液配方)
    
25. 筛选培养基 (见溶液配方)
    

仪器设备

1. 超净台
   
2. 酒精灯
   
3. 镊子
   
4. 刀片
   
5. 刀柄
   
6. 平皿
   
7. 三角瓶
   
8. 摇床
   
9. 培养箱
   
10. 4 °C冷库
    
11. -80 °C冰箱
    
12. 离心机
    
13. 紫外分光光度计
    
14. 无菌过滤器
    

实验步骤

1. 播种：柑橘果实完全成熟时进行采摘，之后进行单果包装，贮存在4 °C冷库中备用。使用时从柑橘果实中取出种子并将种子表面的果肉洗掉，将种子浸泡在1 mol/L NaOH中10 min去除表面果胶，之后用蒸馏水清洗3次，洗除NaOH。然后剥除外种皮，用浓度为3% (w/v) 的NaClO浸泡消毒15 min左右，用无菌水清洗至少3次，直至无菌水变无色，避免残留的NaClO对种子造成毒害作用。用镊子将消毒好的种子置于垫有滤纸的玻璃皿上去除内种皮，并接种于MT播种培养基上，封口置于暗下培养。
   
2. 农杆菌划线活化：在侵染的前4 d，取带有目的基因的农杆菌 (-80 °C冰箱) 在含50 mg/ml kanamycin的LB培养基上划线活化，置于28 °C培养箱培养2 d。待长出单克隆后挑选单克隆，在含50 mg/ml kanamycin的LB培养基上划线，置于28 °C培养箱培养2 d。
   
3. 农杆菌的侵染：侵染前，将活化的农杆菌刮入悬浮培养基 (见溶液配方) 中，悬浮培养基加入50 mg/ml AS (见溶液配方)，28 °C，180-200 rpm震荡培养30 min-1 h，然后用悬浮培养基调节菌液浓度至OD₆₀₀ = 0.6-0.7。
   
4. 外植体-茎段的准备：将黄化苗从暗环境中取出，光下转绿只是7-10 d，待完全转绿后，从培养基中取出，铺于带有滤纸的大皿中，用刀尖斜切45°，保证茎段两端的切口方向一致，长度大约为1 cm左右，及时转移至悬浮培养基中 (防止茎段干枯)。
   
5. 侵染与共培养：将茎段放入农杆菌悬浮液中，摇晃侵染10 min，静置10 min。倒掉菌液，用灭菌滤纸吸干茎段表面的菌液。随后将茎段转入表面覆盖有一层灭菌滤纸的共培养培养基 (见溶液配方)，转入21 °C培养箱继续暗培养3 d。
   
6. 清菌：共培养完成后，将茎段用镊子转移到空的灭菌容器 (建议口比较大的玻璃瓶，便于操作) 中。用含有400 mg/ml cef灭菌蒸馏水浸泡5 min，之后用灭菌蒸馏水反复清洗茎段3-5次，倒掉废液，用灭菌滤纸尽量吸干茎段表面的水分，平铺摆放在筛选培养基中，保证两端的切口朝上，同时每根茎段之间留有一定的空隙。最后，先在28 °C培养箱暗培养7 d，随后转移至光下培养。
   
7. 生根：待再生芽长出至少两片叶子，且茎段有一定长度时，斜切下来，转移至生根培养基中，直至长出根系为止。
   
8. 炼苗：再生完整根系后，挑选根系健壮、生长势好的再生苗炼苗2周，最后移栽到温室。
   

结果与分析

注意事项

1. 由于种子保存在4 °C冰箱，一些染有内生菌的种子在播种时不易被识别，导致同一批次种子全部污染。因此首先要保证种子的质量，要求选用内生菌少且活力较高的种子。
   
2. 黄化苗的状态很关键，当黄化苗从暗环境中取出置于光下转绿时，不同材料转绿所需时间也不相同，可自行判断。一定要选择长势好的黄化苗进行侵染。
   
3. 侵染过程中，菌液浓度要求严格，最好控制在在0.6-0.7之间。
   
4. 再生根系过程中，易长农杆菌，需及时清洗转移。
   

溶液配方

1. 50 mg/ml AS储备液
   AS 1 g加入20 ml DMSO搅拌完全溶解，用有机无菌过滤器过滤，-20 °C保存
   
2. 400 mg/ml Cef储备液
   Cef 20 g加入50 ml灭过菌的水中搅拌完全溶解，用水溶性无菌过滤器过滤，-20 °C保存
   
3. 50 mg/ml Kan储备液
   Kan 1 g加入20 ml灭过菌的水中搅拌完全溶解，用水溶性无菌过滤器过滤，-20 °C保存
   
4. 共培养基配制方法
   先配制生芽培养基，高压灭菌。之后放于微波炉中煮沸，待冷却至70 °C左右，按照1:1,000加入50 mg/ml AS，冷却，常温保存
   
5. 筛选培养基配制方法
   先配制生芽培养基，高压灭菌。之后放于微波炉中煮沸，待冷却至70 °C左右，按照1:1,000加入400 mg/ml Cef和50 mg/ml Kan，冷却，常温保存
   

参考文献

1. 刘丹，肖诗鑫，邓秀新，郭文武. (2018). 柑橘原生质体融合-电融合. Bio-101 e1010186. Doi: 10.21769/BioProtoc.1010186.
   
2. 杨雯惠，解凯东，郭文武. (2018). 柑橘组织培养常用培养基配制方法. Bio-101 e1010184. Doi: 10.21769/BioProtoc.1010184.