水稻白叶枯病菌及细菌性条斑病菌培养及接种

材料与试剂

1. 枪头
   
2. 0.5 ml离心管
   
3. 注射器
   
4. Xanthomonas oryzae pv. oryzae, Xoo
   
5. Xanthomonas oryzae pv. oryzicola, Xoc
   
6. Tryptone (Oxoid, England, catalog number: LP0042)
   
7. Agar (武汉创新生物技术有限公司，中国，catalog number: BM0212)
   
8. Na₂HPO₄·12H₂O (国药集团化学试剂有限公司，中国，分析纯)
   
9. Ca(NO₃)₂·4H₂O (国药集团化学试剂有限公司，中国，分析纯)
   
10. NaCl (国药集团化学试剂有限公司，中国，分析纯)
    
11. KCl (国药集团化学试剂有限公司，中国，分析纯)
    
12. KH₂PO₄ (国药集团化学试剂有限公司，中国，分析纯)
    
13. 蔗糖 (国药集团化学试剂有限公司，中国，分析纯)
    
14. 甘油(国药集团化学试剂有限公司，中国，分析纯)
    
15. 马铃薯培养基 (见溶液配方)
    
16. PBS (见溶液配方)
    

仪器设备

1. -70 °C冰箱
   
2. 超净工作台
   
3. 接种环
   
4. 温箱
   

实验步骤

一、水稻白叶枯病菌及细菌性条斑病菌的培养

1. 取出于-70 °C保存的菌株，于超净工作台上用灭菌枪头吸取菌液至土豆斜面培养基上，用灭菌接种环涂布均匀。
   
2. 置于28 °C温箱内培养3天，细菌长成亮黄色，可将其置于4 °C存放一个月，使用时按照步骤1中所述方法将其转接至新的培养基上。
   
3. 再次转接后的生根管置于28 °C温箱内培养2天，细菌长成亮黄色，可用于保存菌株或接种实验。
   
   

二、水稻白叶枯病菌及细菌性条斑病菌的菌株保存
上述步骤3中培养好的菌体，若需长久保存菌株时，向生根管中加入10-30 ml灭菌的30%甘油，与菌体混匀后，分装至灭菌的0.5 ml离心管中，置于-70 °C长久保存。

三、水稻白叶枯病菌的接种及调查方法

1. 菌体于28 °C温箱内培养2天长成亮黄色后，用PBS溶液稀释，采用比浊法将浓度稀释至约9 x 10⁹个细菌/ml。
   
2. 接种采用剪叶法，于水稻孕穗期接种 (也可于水稻幼苗期接种)。接种时用剪刀蘸取菌液，剪去剑叶 (幼苗期接种时选取完全伸展的叶片接种) 叶尖约2 cm长部分。每个单株至少接种5片剑叶。
   
3. 通常在接种14天或21天后进行调查。调查时量取病斑长度及病叶长度，依据病斑面积 (病斑长度/病叶长度) 衡量病情。每个单株至少调查5片剑叶。
   
   

四、水稻细菌性条斑病菌的接种及调查方法

1. 细菌的培养及稀释同白叶枯病菌。
   
2. 接种采用渗透法(视频1)或针刺法(视频2)，于水稻幼苗期或孕穗期接种。幼苗期接种时选取完全伸展的叶片接种，孕穗期接种时选取剑叶接种。采用渗透法接种时，用一次性注射器吸取菌液，将注射口按住叶片，用力推动注射器，使菌液通过压力渗入叶片内。采用针刺法接种时，用一次性注射器吸取菌液后，将注射口装上针头，推动注射器使针孔中充满菌液，之后将针头刺入叶片，菌液随针头被带入叶片内。
   
   
   
   视频1. 渗透法接种水稻细菌性条斑病
   
   
   
   视频2. 针刺法接种水稻细菌性条斑病
   
   
3. 通常在接种14天或21天后进行调查。调查时用刻度尺测量病斑长度，每个单株至少测量5片剑叶并取其平均值作为该单株的发病长度。(图1)
   
   
   图1. 水稻白叶枯病及细菌性条斑病接种结果示意图
   
   

注：

溶液配方

1. 马铃薯培养基
   

   马铃薯	300g (去皮煮熟后过滤取汁液)
   Na2HPO4·12H2O	2 g
   Ca(NO3)2·4H2O	0.5 g
   Tryptone	5 g
   蔗糖	15 g
   Agar	20 g

   加蒸馏水至1 L，调pH至6.8-7.0，分装至生根管中，封口后灭菌，趁热将生根管倾斜待培养基凝固，使培养基在生根管中形成斜面。
   
2. PBS

   NaCl	8 g
   KCl	0.2 g
   Na2HPO4·12H2O	3.628 g
   KH2PO4	0.24 g

   加入灭菌去离子水至终体积为1 L，用NaOH或HCl调节pH至7.4。