农杆菌介导的籼稻遗传转化

刘瑜, 凌飞, 林拥军 and 陈浩

实验原理：农杆菌是普遍存在于土壤中的一种革兰氏阴性细菌，它能在一定条件下趋化性地感染植物的受伤部位，并诱导产生冠瘿瘤或发状根。根癌农杆菌和发根农杆菌细胞中分别含有Ti质粒和Ri质粒，它们都含有一段可转移的DNA(T-DNA)，农杆菌通过侵染植物伤口，可以将T-DNA插入到植物基因组中，并且稳定的遗传给后代。本实验是把目的基因装载到经过改造的Ti质粒的T-DNA区，借助农杆菌的感染实现外源基因向水稻愈伤的转移与整合，然后通过组织培养技术，再生出转化植株。
实验目的：通过农杆菌介导的遗传转化把目的基因导入到籼稻品种中(MH63，ZS97，9311等)。

关键词: 籼稻, 根癌农杆菌, 遗传转化

材料与试剂

  1. 吸水纸
  2. 滤纸
  3. 大培养皿
  4. 小培养皿
  5. 封口膜
  6. Parafilm
  7. 接种环
  8. 籼稻种子
  9. EHA105农杆菌 (携带含目的基因载体)
  10. 乙醇
  11. 6-Benzylaminopurine (6-BA) (Sigma, catalog number: B-3408)
  12. Kinetin (KT) (Sigma, catalog number: K-0753)
  13. Naphthalene acetic acid (NAA) (Sigma, catalog number: N-0640)
  14. Indole-3-acetic acid (IAA) (Sigma, catalog number: I-2886)
  15. 2, 4-Dichlorophenoxyacetic acid (2, 4-D) (Sigma, catalog number: D-7299)
  16. Kanamycin (USB, catalog number: 17924)
  17. Casein Enzymatic Hydrolysate (CH) (Sigma, catalog number: N-4642)
  18. Carbenicillin (Cn) (Bio Basic INC., catalog number: CDJ469)
  19. Hygromycin B (Hn) (Roche, catalog number: 10843555001)
  20. Nicotinic acid (Sigma, catalog number: N-0765)
  21. Pyridoxine HCl (VB6) (Sigma, catalog number: P-8666)
  22. Thiamine HCl (VB1) (Sigma, catalog number: T-3902)
  23. Inositol (Sigma, catalog number: I-3011)
  24. Phytagel (Sigma, catalog number: P-8169)
  25. Dimethyl Sulfoxide (DMSO) (Sigma, catalog number: D-5879)
  26. Acetosringone (AS) (Aldrich chem., CO 01531 EG)
  27. Proline
  28. Sucrose
  29. Agar powder
  30. D-sorbitol
  31. NH4NO3
  32. KNO3
  33. KH2PO4
  34. MgSO4∙7H2O
  35. CaCl2
  36. CaCl2∙2H2O
  37. MnSO4∙4H2O
  38. ZnSO4∙7H2O
  39. H3BO3
  40. KI
  41. Na2MoO4∙2H2O
  42. CoCl2∙6H2O
  43. CuSO4∙5H2O
  44. (NH4)2SO4
  45. FeSO4∙7H2O
  46. Na2 EDTA∙2H2O
  47. Glycine
  48. KOH
  49. HgCl2
  50. Glucose
  51. MSmax储备液(10x) (见溶液配方)
  52. MSmin储备液(100x) (见溶液配方)
  53. N6max储备液(10x) (见溶液配方)
  54. N6min储备液(100x) (见溶液配方)
  55. Fe2+-EDTA储备液(100x) (见溶液配方)
  56. Vitamin储备液(100x) (见溶液配方)
  57. 6-BA储备液(1 mg/ml) (见溶液配方)
  58. KT储备液(1 mg/ml) (见溶液配方)
  59. 2, 4-D储备液(1 mg/ml) (见溶液配方)
  60. IAA储备液(1 mg/ml) (见溶液配方)
  61. NAA储备液(1 mg/ml) (见溶液配方)
  62. 200 mM AS储备液(见溶液配方)
  63. 1 N KOH储备液(见溶液配方)
  64. 0.15% HgCl2 (见溶液配方)
  65. 50%葡萄糖(见溶液配方)
  66. 250 mg/ml CN (见溶液配方)
  67. 50 mg/ml Kan (见溶液配方)
  68. 诱导培养基(见溶液配方)
  69. 继代培养基(见溶液配方)
  70. 预培养基(见溶液配方)
  71. 悬浮培养基(见溶液配方)
  72. 共培养基(见溶液配方)
  73. 筛选培养基(见溶液配方)
  74. 预分化培养基(见溶液配方)
  75. 分化培养基(见溶液配方)
  76. 生根培养基(见溶液配方)
    注：以上所有常规试剂都是由国药化工和光复科技提供。

仪器设备

  1. 超净工作台
  2. 100 ml三角瓶
  3. 250 ml三角瓶
  4. 500 ml三角瓶
  5. 生根管
  6. 剪刀
  7. 镊子
  8. 小铁勺
  9. 酒精灯
  10. 28 °C摇床
  11. 19 °C培养箱

实验步骤

  1. 诱导愈伤
    1.1
    成熟种子去掉颖壳，用75%乙醇浸泡1 min，然后用0.15% HgCl2浸泡15-20 min，最后用无菌蒸馏水漂洗4~5次。
    1.2
    每瓶诱导培养基 (见溶液配方) 接入8~10粒种子，26 °C暗培养35 d。
  2. 继代
    2.1
    提前2~3 d准备好继代培养基 (见溶液配方)，使培养基干燥。
    2.2
    用镊子将新长出来的愈伤夹成小块，转入新的继代培养基中，每瓶约20粒，在26°C恒温暗室培养20 d后，可以长出颜色鲜黄直径约为为2~3 mm的胚性愈伤组织颗粒。大小合适的愈伤可以进行预培养，小的就进行第二次继代。
  3. 预培养
    3.1
    每250 ml预培养基 (见溶液配方) 中加入250 μl AS与5 ml 50% (w/v)葡萄糖并倒皿，每瓶培养基倒8~10个皿。
    3.2
    选取自然分散，颜色鲜黄，直径约为2~3 mm的胚性愈伤组织颗粒转入预培养基中，每皿为80粒愈伤颗粒，在26 °C恒温暗培养4 d。
  4. 侵染
    4.1
    提前将含有目的基因的农杆菌菌株划线活化 (28 °C培养36-48 h)。
    4.2
    准备灭菌的悬浮培养基 (见溶液配方)，共培养基 (见溶液配方)，大培养皿，小培养皿 (里面垫有吸水纸和滤纸，用前灭菌并置于80 °C烘干)，250 ml无菌三角瓶若干。
    4.3
    将划线培养的农杆菌刮入悬浮培养基(每100 ml培养基加入100 μl AS)，28 °C，200 rpm振荡培养2~3 h，然后调整菌液浓度至OD600≈0.5。
    4.4
    收集预培养的愈伤组织到250 ml的无菌三角瓶中；然后把培养好的农杆菌菌液倒入装有愈伤组织的三角瓶中，浸泡30 min。
    4.5
    浸泡完后，先倒掉菌液，将装有愈伤组织的三角瓶倒扣于装有滤纸的无菌小皿上，沥干菌液，再把愈伤颗粒铺在装有7层以上滤纸的无菌大皿上，从下面抽一张无菌滤纸盖在愈伤上，用镊子轻压愈伤吸干表面菌液，弃掉上面滤纸，重复上述工作至少4次，最后在愈伤颗粒上盖一张滤纸，盖好大皿，自然干燥2 h。
    4.6
    愈伤干燥时，每250 ml共培养基中加入250 μl AS和5 ml 50% (w/v)葡萄糖并倒皿，每瓶培养基倒8~10个平皿。
    4.7
    用无菌勺子将充分干燥的愈伤组织均匀地平铺在共培养基上 (铺上之后不要再挪动，减少培养基与愈伤表面的接触，防止农杆菌的过度生长)，用Parafilm封口。
    4.8
    19 °C暗培养3 d。
  5. 水洗与筛选
    5.1
    准备无菌蒸馏水，大、小皿 (含有吸水纸和滤纸，灭菌后置于80 °C烘干)，250 ml三角瓶若干，筛选培养基。
    5.2
    用无菌勺子将共培养完成后的愈伤颗粒收集到250 ml的三角瓶中，用无菌的蒸馏水清洗6次以上，直至倒出的蒸馏水清亮即可，最后加150 ml蒸馏水，以及300 μl Cn，室温浸泡30 min。
    5.3
    浸泡完后，先倒掉菌液，将装有愈伤组织的三角瓶倒扣于装有滤纸的无菌小皿上，沥干菌液，再把愈伤颗粒铺在装有7层以上滤纸的无菌大皿上，从下面抽一张无菌滤纸盖在愈伤上，用镊子轻压愈伤吸干表面菌液，弃掉上面滤纸，重复上述工作至少4次，最后在愈伤颗粒上盖一张滤纸，盖好大皿，自然干燥2 h。
    5.4
    愈伤干燥时，将每250 ml筛选培养基中加入400 μl Cn与250 μl Hn (终浓度400 mg/L Cn和50 mg/L Hn)，然后倒8~9个平皿。
    5.5
    将干燥后的愈伤颗粒转移到筛选培养基(S1)中，每皿摆放约40颗愈伤，暗室26 °C恒温培养15 d。
  6. 第二次筛选(S2)
    6.1
    准备筛选培养基(见溶液配方)，每250 ml培养基中加入300 μl Cn和250 μl Hn (终浓度300 mg/L Cn和50 mg/L Hn)，倒8~9个平皿。
    6.2
    将S1培养基上干燥的，没有农杆菌污染的愈伤颗粒转接到新的筛选培养基(S2)上，每皿摆放约25粒；暗室26 °C恒温培养20 d。
    6.3
    在此期间，观察是否长出新鲜嫩黄的抗性愈伤，如果没有抗性愈伤出现，把愈伤组织转接到新的筛选培养基上(S3)，S3筛选培养基除Cn浓度适当降低(终浓度250 mg/L)外其他同S2。继续暗室26 °C恒温培养，直至长出新的抗性愈伤。
  7. 分化
    7.1
    从筛选培养基中将抗性愈伤(每一团只挑一颗抗性愈伤)转移至预分化培养基 (见溶液配方)中(含50 mg/L Hn和200 mg/L Cn)，暗室26 °C恒温培养一周。
    7.2
    从预分化培养基中挑选无褐化死亡的抗性愈伤转移到分化培养基 (见溶液配方) 中，28 °C、光照14 h/黑暗10 h培养30~35 d。通常一周后愈伤开始转绿，三周后开始长出幼芽。
  8. 生根
    准备装有1/4生根培养基(见溶液配方)的生根管。从分化培养基中挑出幼苗 (同一块愈伤组织若分化出多株幼苗，则挑选长势最好的一株)，用灭菌的剪刀剪去老根和周围附着的愈伤，然后接入生根管内，28 °C、光照14 h/黑暗10 h培养10~20 d (根据幼苗大小决定生长时间)。
  9. 炼苗与移栽
    生根完成后开盖，加入自来水继续培养3 d，然后取出再生植株用水洗掉生根培养基，修剪根部和叶部，移栽到温室。

注意事项

  1. 整套过程必须在无菌条件下操作，尽量做到少污染。
  2. 污染的材料要求及时清理，以免扩大污染。
  3. 尽量挑取活力强的愈伤进行试验。
  4. 在整个转化过程中，愈伤组织或者分化后的幼苗长至适当状态，应当尽快进行下一步操作 (尽量减少组织培养时间可减少体细胞突变)。

溶液配方

一、溶液配置

  1. MSmax储备液(10x)
    NH4NO3
    		 16.5 g
    KNO3
    		 19.0 g
    KH2PO4
    		 1.7 g
    MgSO4·7H2O
    		 3.7 g
    CaCl2
    		 3.32 g or CaCl2∙2H2O 4.4 g
    逐个溶解，然后加蒸馏水定容至1 L。
  2. MSmin储备液(100x)
    MnSO4·4H2O
    		 2.23 g
    ZnSO4·7H2O
    		 0.86 g
    H3BO3
    		 0.62 g
    KI
    		 0.083 g
    Na2MoO4·2H2O
    		 0.025 g
    CoCl2·6H2O
    		 0.0025 g
    CuSO4·5H2O
    		 0.0025 g
    注：Na2MoO4·2H2O必须单独溶解，再与其它组分混合，加蒸馏水定容到1 L，室温保存。
  3. N6max储备液(10x)
    KNO3
    		 28.3 g
    KH2PO4
    		4.0 g
    (NH4)2SO4
    		 4.63 g
    MgSO4∙7H2O
    		 1.85 g
    CaCl2
    		 1.25 g or CaCl2∙2H2O 1.66 g
    逐个溶解，然后加蒸馏水定容到1 L。
  4. 继代A储备液(10x)
    NH4NO3
    		 17 g
    KNO3
    		 19.0 g
    KH2PO4
    		 1.7 g
    MgSO4·7H2O
    		 3.7 g
    CaCl2
    		 3.02 g or CaCl2∙2H2O 4 g
    逐个溶解，然后加蒸馏水定容至1 L。
  5. 继代B储备液(100x)
    MnSO4·4H2O
    		 10 g
    ZnSO4·7H2O
    		 2 g
    H3BO3
    		 3 g
    KI
    		 0.75 g
    Na2MoO4·2H2O
    		 0.25 g
    CoCl2·6H2O
    		 0.025 g
    CuSO4·5H2O
    		 0.025 g
    注：Na2MoO4·2H2O必须单独溶解，再与其它组分混合，加蒸馏水定容至1 L，4°C保存。
  6. Fe2+-EDTA储备液(100x)
    在一个试剂瓶中加入300 ml蒸馏水，然后加入
    FeSO4∙7H2O
    		 2.78 g
    在另一试剂瓶中加入300 ml蒸馏水，并加热到70 °C，然后加入
    Na2 EDTA∙2H2O
    		 3.73 g
    都溶解好后，将两个试剂瓶中的溶液混合，70 °C保温2 h，然后加入蒸馏水定容至1 L，4 °C避光保存。
  7. Vitamin储备液(100x)
    Nicotinic acid
    		 0.1 g
    Pyridoxine HCl (VB6)
    		 0.1 g
    Thiamine HCl (VB1)
    		 0.1 g
    Glycine
    		 0.2 g
    Inositol
    		 10 g
    加蒸馏水定容到1 L，4 °C避光保存。
  8. AAmax储备液(10x)
    KCl
    		 29.5 g
    MgSO4·7H2O
    		 2.5 g
    NaH2PO4
    		 1.5 g
    CaCl2∙2H2O
    		 1.5 g
    加蒸馏水定容到1 L，室温避光保存。
  9. AAmin储备液(100x)
    MnSO4∙H2O
    		 1.0 g
    H3BO3
    		 0.3 g
    ZnSO4∙7H2O
    		 0.2 g
    KI
    		 0.075 g
    Na2MoO4∙2H2O
    		 0.025 g
    CuSO4∙5H2O
    		 0.0025 g
    CoCl2∙6H2O
    		 0.0025 g
    注：Na2MoO4单独溶解，然后与其它组分混合并加蒸馏水定容至1 L，室温避光保存。
  10. 6-BA储备液(1 mg/ml)
    6-BA
    		 100 mg
    加入1.0 ml 1 N KOH搅拌至6-BA完全溶解，然后加蒸馏水定容到100 ml，室温保存。
  11. KT储备液(1 mg/ml)
    KT
    		 100 mg
    加入1.0 ml 1 N KOH搅拌至KT完全溶解，然后加蒸馏水定容到100 ml，室温保存。
  12. 2, 4-D储备液(1 mg/ml)
    2, 4-D
    		 100 mg
    加入1.0 ml 1N KOH搅拌5 min，然后加10 ml蒸馏水搅拌至2,4-D完全溶解，用蒸馏水定容至100 ml，室温保存。
  13. IAA储备液(1 mg/ml)
    IAA
    		 100 mg
    加入1.0 ml 1N KOH搅拌至IAA完全溶解，然后用蒸馏水定容至100 ml，室温避光保存。
  14. NAA储备液(1 mg/ml)
    NAA
    		 100 mg
    加入1.0 ml 1N KOH搅拌至NAA完全溶解，然后用蒸馏水定容到100 ml，室温避光保存。
  15. 100 mM AS储备液
    AS
    		 0.196 g
    DMSO
    		 10 ml
    用1.5 ml离心管分装，4 °C保存。
  16. 1 N KOH储备液
    KOH
    		 5.6 g
    用100 ml蒸馏水溶解，室温保存。
  17. 0.15% HgCl2
    HgCl2
    		 1.5 g
    先加600 ml蒸馏水完全溶解，再加入100 μl吐温20，然后用蒸馏水定容至1 L。
  18. 50%葡萄糖
    Glucose
    		 25 g
    加蒸馏水溶解后定容至50 ml，高压灭菌后4 °C保存。
  19. Carbenicillin (Cn)
    Carbenicillin
    		 1 g
    加ddH2O定容至4 ml，分装至1.5 ml离心管，-20 °C保存。

二、培养基配置 
  1. 诱导培养基
    MSmax储备液(10x)
    		 100 ml
    MSmin储备液(100x)
    		 10 ml
    Fe2+-EDTA储备液(100x)
    		 10 ml
    Vitamin储备液(100x)
    		 10 ml
    2, 4-D储备液
    		 2.5 ml
    Proline
    		 0.5 g
    Glutamine
    		 0.5 g
    Casein Enzymatic Hydrolysate
    		 0.6 g
    Sucrose
    		30 g
    Phytagel
    		 3 g
    先加入900 mL蒸馏水，用1 N KOH调至pH值为6.0，加蒸馏水定容至1 L，然后煮沸分装至100 ml三角瓶，高压灭菌。
  2. 继代培养基
    继代A储备液(10x)
    		 100 ml
    继代B储备液(100x)
    		 10 ml
    Fe2+-EDTA储备液(100x)
    		 10 ml
    Vitamin储备液(100x)
    		 10 ml
    2, 4-D储备液
    		 3.0 ml
    Proline
    		 0.6 g
    Glutamine
    		 0.5 g
    Casein Enzymatic Hydrolysate
    		 0.8 g
    Maltose
    		 30 g
    Phytagel
    		 3.0 g
    先加入900 ml蒸馏水，用1 N KOH调至pH值为6.0，加蒸馏水定容至1 L，然后煮沸分装至100 ml三角瓶，高压灭菌。
  3. 预培养基
    MSmax储备液(10x)
    		 12.5 ml
    MSmin储备液(100x)
    		 1.25 ml
    Fe2+-EDTA储备液(100x)
    		 1.25 ml
    Vitamin储备液(100x)
    		 1.25 ml
    2, 4-D储备液
    		 0.75 ml
    Maltose
    		 5.0 g
    Agarose
    		 1.75 g
    先加入200 ml蒸馏水，用1 N KOH调至pH值为5.6，加蒸馏水定容至250 ml，高压灭菌。使用之前加入5 ml 50%葡萄糖与250 μl AS储备液。
  4. 悬浮培养基
    AAmax储备液(10x)
    		 10 ml
    AAmin储备液(100x)
    		 1 ml
    Fe2+-EDTA储备液(100x)
    		 1 ml
    Vitamin储备液(100x)
    		 1 ml
    2, 4-D储备液
    		 0.2 ml
    Glutamine
    		 0.0876 g
    Asparagine
    		 0.0216 g
    Arginine
    		 0.0176 g
    Maltose
    		 2 g
    Glucose
    		 1 g
    用1 N KOH调至pH值为5.4，加蒸馏水定容至100 ml，高压灭菌，使用时加入100 μl AS储备液。
  5. 共培养基
    MSmax储备液(10x)
    		 6.25 ml
    MSmin储备液(100x)
    		 1.25 ml
    Fe2+-EDTA储备液(100x)
    		 2.5 ml
    Vitamin储备液(100x)
    		 2.5 ml
    2, 4-D储备液
    		 0.75 ml
    Casein Enzymatic Hydrolysate
    		 0.2 g
    Maltose
    		 5.0 g
    Agarose
    		 1.75 g
    先加入200 ml蒸馏水，用1 N KOH调至pH值为5.4，加蒸馏水定容至250 ml，高压灭菌。使用之前加入5 ml 50%葡萄糖与250 μl AS储备液。
  6. 筛选培养基
    继代A储备液(10x)
    		 25 ml
    继代B储备液(100x)
    		 2.5 ml
    Fe2+-EDTA储备液(100x)
    		 2.5 ml
    Vitamin储备液(100x)
    		 2.5 ml
    2, 4-D储备液
    		 0.625 ml
    Proline
    		 0.15 g
    Glutamine
    		 0.1 g
    Casein Enzymatic Hydrolysate
    		 0.15 g
    Maltose
    		 7.5 g
    Agarose
    		 1.75 g
    先加入200 ml蒸馏水，用1 N KOH调至pH值为6.0，加蒸馏水定容至250 ml，高压灭菌。
  7. 预分化培养基
    N6max储备液(10x)
    		 25 ml
    继代B储备液(100x)
    		 2.5 ml
    Fe2+-EDTA储备液(100x)
    		 2.5 ml
    Vitamin储备液(100x)
    		 2.5 ml
    6-BA储备液
    		 0.5 ml
    KT储备液
    		 0.5 ml
    NAA储备液
    		 50 μl
    IAA储备液
    		 50 μl
    Proline
    		 0.15 g
    Casein Enzymatic Hydrolysate
    		 0.15 g
    Maltose
    		 5.0 g
    Sucrose
    		 2.5 g
    Agarose
    		 1.75 g
    先加入200 ml蒸馏水，用1 N KOH调至pH值为5.9，加蒸馏水定容至250 ml，高压灭菌。
  8. 分化培养基
    N6max储备液(10x)
    		 100 ml
    继代B储备液(100x)
    		 6 ml
    Fe2+-EDTA储备液(100x)10  ml
    Vitamin储备液(100x)
    		 10 ml
    6-BA储备液 2.0 ml
    KT储备液
    		 2.0 ml
    IAA储备液 0.2 ml
    NAA储备液 0.2 ml
    Proline
    		 0.6 g
    Casein Enzymatic Hydrolysate 1 g
    Maltose
    		 20 g
    Sucrose
    		 10 g
    Agarose 3.0 g
    先加入900 ml蒸馏水，用1 N KOH调至pH值为6.0，补蒸馏水定容至1 L，然后煮沸分装至100 ml三角瓶，高压灭菌。
  9. 生根培养基
    MSmax储备液(10x)
    		 50 ml
    MSmin储备液(100x)
    		 5 ml
    Fe2+-EDTA储备液(100x)
    		 10 ml
    Vitamin储备液(100x)
    		 10 ml
    Sucrose
    		 20 g
    Phytagel
    		 3 g
    先加入900 ml蒸馏水，用1 N KOH调至pH值为5.8，加蒸馏水定容至1 L，然后煮沸分装至生根管，高压灭菌。
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Copyright: © 2018 The Authors; exclusive licensee Bio-protocol LLC.
引用格式：刘瑜, 凌飞, 林拥军, 陈浩. (2018). 农杆菌介导的籼稻遗传转化. Bio-101: e1010175. DOI: 10.21769/BioProtoc.1010175.
How to cite: Liu, Y., Ling, F., Lin, Y. J. and Chen, H. (2018). Agrobacterium-mediated Transformation of Indica Rice. Bio-101: e1010175. DOI: 10.21769/BioProtoc.1010175.
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