水稻组织脯氨酸含量的测定

材料与试剂

1. 10 ml离心管
   
2. 1.5 ml离心管
   
3. 冰醋酸及磷酸
   
4. 甲苯
   
5. 茚三酮
   
6. 磺基水杨酸
   
7. 脯氨酸 (Sigma, USA, catalog number: P0380)
   
8. 酸性茚三酮溶液 (见溶液配方)
   
9. 3%磺基水杨酸 (见溶液配方)
   

仪器设备

1. 100 ml容量瓶及50 ml容量瓶
   
2. 分析天平
   
3. 烧杯
   
4. 剪刀
   
5. 电磁炉
   
6. 分光光度计DU640 (Backman，USA)
   

实验步骤

1. 标准曲线的绘制
   1.1

   在分析天平上精确称取10 mg脯氨酸，倒入小烧杯内，用少量蒸馏水溶解，然后倒入100 ml容量瓶中，加蒸馏水定容至刻度，此标准液中每毫升含脯氨酸100 μg。
   
   1.2

   系列脯氨酸浓度的配置。取6个50 ml容量瓶，分别盛入脯氨酸原液0.5 ml、1.0 ml、1.5 ml、2.0 ml、2.5 ml及3.0 ml，用蒸馏水定容至刻度，摇匀，各瓶的脯氨酸浓度分别为1 μg/ml、2 μg/ml、3 μg/ml、4 μg/ml、5 μg/ml及6 μg/ml。
   
   1.3

   取6个10 ml离心管，分别吸取2 ml系列标准浓度的脯氨酸溶液及2 ml冰醋酸和2 ml酸性茚三酮溶液，每管在沸水浴中加热30 min。
   
   1.4

   冷却后各试管准确加入4 ml甲苯作为萃取液，振荡1 min，静置片刻，使色素全部转至萃取液中。
   
   1.5

   用移液器轻轻吸取各管上层脯氨酸甲苯溶液至比色杯中，以甲苯溶液为空白对照，于520 nm波长处进行比色。
   
   1.6

   标准曲线的绘制：先求出吸光度值(Y)依脯氨酸浓度(X)而变的回归方程式，再按回归方程式绘制标准曲线，计算2 ml测定液中脯氨酸的含量(μg /ml)。 
2. 样品的测定
   2.1

   取水稻叶片或其他组织于塑料袋或离心管中，置于冰上带回室内。
   
   2.2

   将样品剪碎并用分析天平精确称取重量 (样品量保持在0.2-0.5 g之间)，置于10 ml离心管中，然后向各管分别加入5 ml 3%的磺基水杨酸溶液，在沸水浴中提取10-30 min (提取过程中要经常摇动)，自然冷却后即为脯氨酸的提取液。
   
   2.3

   吸取2 ml提取液于另一干净的10 ml离心管中，加入2 ml冰醋酸及2 ml酸性茚三酮试剂，在沸水浴中加热30 min，溶液即呈红色。
   
   2.4

   自然冷却后加入4 ml甲苯，摇荡1 min，静置10 min，也可以室温放置1-3天待测定，取上层有颜色溶液至1.5 ml离心管中，室温12,000 r/min离心15 min。
   
   2.5

   用移液器轻轻吸取上层脯氨酸红色甲苯溶液于比色杯中，以甲苯为空白对照，在分光光度计上520 nm波长处比色，求得吸光度值。

结果与分析

根据回归方程计算出 (或从标准曲线上查出) 测定液中脯氨酸的浓度X (μg/ml)，然后计算每克鲜重样品中脯氨酸含量 (μg/g FW)。计算公式如下：
单位鲜重样品的脯氨酸含量 (μg/g FW) = (X*5)/样重

注意事项

1. 萃取液是易燃、易挥发有毒液体，测定时要在通风橱中进行。

溶液配方

1. 酸性茚三酮溶液
   将1.25 g茚三酮溶于30 ml冰醋酸和20 ml 6 mol/L磷酸中，搅拌加热 (70 °C) 溶解，贮于冰箱中 (4 °C)
   
2. 3%磺基水杨酸
   3 g磺基水杨酸加蒸馏水溶解后定容至100 ml