外源蛋白在烟草叶片瞬时表达

材料与试剂

1. 一次性注射器
   
2. 培养皿
   
3. 本氏烟草 (Nicotiana benthamiana)
   
4. 农杆菌菌株：EHA105
   
5. MES
   
6. MgCl₂
   
7. 乙酰丁香酮 (acetosyringone, AS) (上海生工，catalog number: A601111)
   
8. 抗生素 (根据实验需求)
   
9. LB
   
10. 0.5 M MES (pH 5.6) (见溶液配方)
    
11. MgCl₂溶液 (见溶液配方)
    
12. 100 mM乙酰丁香酮 (见溶液配方)
    

仪器设备

1. 恒温摇床
   
2. 分光光度计
   
3. 移液枪
   
4. 离心机
   

实验步骤

1. 挑取转化有表达质粒的农杆菌克隆(菌株：EHA105)于1 ml含有相应抗生素的LB中，28度摇床250 rpm培养24小时。
   
2. 于5 ml含有相应抗生素的LB中，加入100 μl 0.5 M MES，2 μl 100 mM AS，再接种50 μl农杆菌菌液，28度摇床250 rpm培养至OD₆₀₀=1.0 (大约12-18小时)。
   
3. 4,000 rpm常温离心10分钟收集菌体，用10 mM MgCl₂重悬至OD₆₀₀=1.0，以每毫升菌液加入2 μl的比例加入100 mM AS，静置3小时以上。
   
4. 取正处于生长旺盛时期(一个月左右，未开花)的本生烟草(Nicotiana benthamiana)，用注射器吸入菌液，去掉针头，以手指抵住叶片正面，将菌液从叶片的反面渗透进去(见图1)，若注射不顺畅，可用针头在叶片上制造一个微小的伤口，再将菌液从伤口注入。
   
   
   图1.烟草叶片农杆菌注射
   
   
5. 正常条件下放置，24-48小时即可取样。

注意事项

1. 有的文献报道烟草注射前需黑暗处理，有的文献则报道需要持续光照处理，个人经验至少对于蛋白表达这一操作来说不需要任何处理，正常条件生长即可，但是用于蛋白互作(BiFC)可能需要特定的条件，可参见BiFC部分 (参见“烟草体系BiFC”，袁猛等，2018)。
   
2. 表达载体的启动子一般是35s启动子，若需要特异基因自身的启动子驱动，需考虑水稻与烟草的单/双子叶植物的区别造成的差异。
   
3. 一般情况下，转化后24小时即有蛋白表达，而48小时后会渐渐消失。
   
4. 若需要提高外源蛋白的表达，可用同样的方法制备含有番茄丛矮病毒基因p19超表达载体的农杆菌，与目的基因的农杆菌等量混合后再注射烟草，此方法的蛋白表达时间为注射后3-7天，且可以大幅提高表达量，但是只适用于本生烟草 (Nicotiana benthamiana) (Voinnet等, 2003)。
   
5. 如果要抽提并纯化蛋白在未用p19的情况下需5-10 g烟草叶片，加p19的情况下可以减半。
   

溶液配方

1. 0.5 M MES (pH 5.6)
   MES粉末溶于双蒸水中，利用1 M KOH溶液调pH值至5.6
   
2. MgCl₂溶液
   MgCl₂粉末溶于双蒸水中
   
3. 100 mM乙酰丁香酮
   乙酰丁香酮粉末溶于双蒸水中
   

参考文献

1. Voinnet, O., Rivas, S., Mestre, P. and Baulcombe, D. (2003). An enhanced transient expression system in plants based on suppression of gene silencing by the p19 protein of tomato bushy stunt virus. Plant J 33(5): 949-956.
   
2. 袁猛，许纯珏等. (2018). 烟草体系BiFC. Bio-101 e1010133. Doi: 10.21769/BioProtoc.1010133.