蛋白-蛋白相互作用检测技术-双分子荧光互补法
Protein-Protein Interaction Detection Method-BiFC   

材料与试剂

1. 15/50 mL离心管
2. 384孔板（Corning，产品目录号: 3712）
3. 96孔板（Corning，产品目录号: 3879）
4. Fugene HD (Promega，产品目录号: E2311)
5. Opti-MEM™ I 减血清培养基，无酚红（Gibco，产品目录号: 11058021）
6. 胰蛋白酶-EDTA (0.25%)，含酚红（GBICO，产品目录号: 25200056）
7. DMEM，高糖（Gibco，产品目录号: 11965092）
8. DPBS，无钙、无镁（Gibco，产品目录号: 14190250）
9. DMSO（Sigma，产品目录号: 276855）
10. Hoechst 33342（Invitrogen，产品目录号: H3570）
11. Propidium Iodide（Invitrogen，产品目录号: P1304MP）
12. DMEM完全培养基（见溶液配方）
    

仪器设备

1. Multidrop自动分液器 (Thermofisher，model：Multidrop Combi)
2. Bravo自动化液体处理平台(Agilent，model：Bravo)
3. Incucyte活细胞长时间动态影像成像分析仪(Essen BioScience，model：Incucyte FLR)
4. Operretta高内涵成像分析仪（PerkinElmer，model：Operretta）
5. 96孔板离心机（Eppendorf，model：5810R）
6. 细胞计数仪（Beckman Coulter）
   

实验步骤

1. 质粒构建
   本实验中以Venus（EYFP的一种突变体）为指示蛋白-蛋白相互作用的荧光蛋白。本例中以Venus 蛋白的第157位氨基酸为截点用限制性内切酶Xho I和Xba I将Venus N端1-157个氨基酸的DNA序列构建到原核表达载体pcDNA™3.1/Hygro (-)（V870-20，invitrogen）上，并命名为NV-157；用限制性内切酶BamH I和Hind III将Venus C端158-239个氨基酸的DNA序列构建到原核表达载体pcDNA™3.1/myc-His(-) A上，并命名为CV-158，得到了基于Venus的互补片段的两个空载蛋白质粒NV-157 和CV-158，空载蛋白质粒可无偿提供给科研单位或非盈利机构。
   构建BiFC系统还需要将有相互作用的一对蛋白分别插入到空载蛋白质粒NV-157和CV-158中。本例中分别将Protein A和Protein B插到NV-157的N端和CV-158的C端，构成Protein A-NV-157 和CV-158-Protein B两种质粒。这两种质粒可共转染构成检测相互作用的BiFC系统。
   
   质粒构建步骤参照《分子克隆实验指南》。
   说明：两种蛋白由于和Venus的片段的组合以及在Venus 片段的N端或C端位置的不同可以有8种组合方式（图2）：1）Protein A-NV-157和CV-158-Protein B，2）Protein A- NV-157和Protein B-CV-158，3）NV-157-Protein A和CV-158-Protein B，4）NV-157-Protein A和Protein B- CV-158，5）Protein B-NV-157和CV-158-Protein A，6）Protein B-NV-157和Protein A-CV-158，7）NV-157-Protein B和CV-158-Protein A，4）NV-157-Protein B和Protein A-CV-158。在实际操作中要根据自己课题中蛋白在细胞中的定位或结合后的功能实验来选择合适的组合方式，保证荧光蛋白可以发出荧光且不影响目的蛋白之间的相互作用及二者结合后功能的发挥。
   
   
   图1. BiFC的原理 (Miller et al.,2015)
   
   
   图2. 目的蛋白与荧光蛋白片段间不同的排列方式示意图
   
   
2. 细胞转染（以HEK293T细胞为例）
   本实验采用悬浮转染的方式进行转染铺板，此处所示的实验步骤仅适用于以悬浮转染的方式瞬时转染两种质粒的情况，下面以一块384孔板的情况为例介绍实验步骤。
   在实验设计中，384孔板的1 - 2列为阳性对照，即共转Protein A-NV-157 和CV-158- Protein B两种质粒的HEK293T细胞用2% DMSO（稀释液为DMEM完全培养基，DMSO是化合物的溶剂，作为无化合物处理的对照同化合物以相同的体积百分比添加）进行处理；3 - 22列为实验组，即共转Protein A-NV-157 和CV-158- Protein B两种质粒的HEK293T细胞以10 μM待筛选的化合物（化合物最终在培养基中的体积百分比为2%）处理；23 - 24列为阴性对照，即共转NV-157 和CV-158两种质粒的HEK293T细胞用2% DMSO进行处理。铺板时每孔的细胞数为8000个，体积为30 μL，细胞浓度为2.67×10⁵个/mL。一块384孔板需准备15 mL共转Protein A-NV-157 和CV-158-Protein B两种质粒的HEK293T细胞以及5 mL共转NV-157 和CV-158两种质粒的HEK293T细胞。
   
   1. 转染前一天对HEK293T细胞进行传代，保证第二天细胞活率大于95%且有5.5×10⁶个的细胞用于转染。
   2. 制备转染复合物。
      转染复合物中质粒的含量与细胞溶液体积的比例是1 μg：1 mL。
      1. Protein A-NV-157 和CV-158-Protein B共转的转染复合物制备：
         质粒：15 μg，其中Protein A-NV-157质粒5g，CV-158- Protein B质粒10 μg；
         Fugene HD：45 μL；
         OPTI-MEM: 200 μL。
      2. NV-157 和CV-158共转的转染复合物制备：
         质粒：5 μg， 其中NV-157质粒1.67 μg，CV-158质粒3.33 μg；
         Fugene HD：15 μL；
         OPTI-MEM: 100 μL。
         说明：1）本次实验中Protein A-NV-157 和CV-158- Protein B两种质粒的比例为1:2；质粒总量和转染试剂的比例是1 μg ：3 μL。
         2）Protein A-NV-157 和CV-158- Protein B两种质粒的比例、以及质粒和转染试剂的比例在方法开发阶段需要通过测试不同比例下的荧光强度与阴性对照的荧光强度的差异，选择荧光强度差异最大且最经济的比例进行实验。
   3. 消化细胞并计数
      1. 弃掉旧培养液，在培养皿中加入5 ml DPBS，晃动培养皿使DPBS均匀覆盖整个培养皿后弃掉DPBS以去除残留培养液；
      2. 培养皿中加入1 mL胰蛋白酶-EDTA (0.25%)溶液，37 °C静置1 min，使细胞从培养皿上解离下来；
      3. 培养皿中加入4 mL DMEM完全培养液，终止胰蛋白酶的消化，反复吹打细胞成单个细胞。
      4. 另取一只1.5 mL EP管加入900 μL DMEM完全培养液，向其中加入100 μL 细胞反复吹打混匀，用细胞计数仪进行细胞计数。（细胞计数的方式可应用实验室现有计数方法）
   4. 细胞转染
      1. 根据细胞计数的结果调整细胞浓度为2.67×10⁵个/mL，总体积为20 mL。
      2. 取15 mL细胞于50 mL离心管中，将制备好的Protein A-NV-157 和CV-158-Protein B共转的转染复合物全部转移至50 mL离心管中，上下颠倒混匀，标记为样品细胞。
      3. 取5 mL细胞于50 mL离心管中，将制备好的NV-157 和CV-158共转的转染复合物全部转移至50 mL离心管中，上下颠倒混匀，标记为阴性对照细胞。
   5. 细胞铺板
      细胞铺板借助于Multidrop Combi，选用standard cassette，每孔30 μL 细胞。
      1. 准备Multidrop（需在超净台中操作）
         Multidrop 安装好standard cassette后，先将standard cassette的进液端放入含10% bleach的容器中prime 50 mL bleach，之后将standard cassette的管路在充满10% bleach的状态下浸泡5 min，随后将standard cassette的进液端转移至含ddH₂O的容器中prime 200 mL ddH₂O以除去10% bleach。
      2. 细胞铺板
         将standard cassette的进液端转移至含DPBS的容器中Prime 50 mL DPBS 后进行细胞铺板。将384孔细胞培养板放置到Multidrop的载板架上，其中384孔板的23-24列每孔加入30 μL阴性对照细胞，加好后将standard cassette Prime 50ml DPBS 之后再向384孔板的1-22列中每孔加入30 μL样品细胞。
      3. 将384孔板800 rpm 离心1 min，置于37 °C培养箱中
   
   
3. 化合物处理
   化合物母液以1 mM的浓度保存于DMSO中，储存于96孔母液板的第2-11列。细胞板中化合物的最终浓度为10 μM，总共需要100倍稀释。
   1. 化合物50倍稀释
      1. 准备Multidrop（需在超净台中操作）。
         Multidrop 安装好standard cassette后，先将standard cassette的进液端放入含10% bleach的容器中prime 50 mL bleach，之后将standard cassette的管路在充满10% bleach的状态下浸泡5 min，随后将standard cassette的进液端转移至含ddH₂O的容器中prime 200 mL ddH₂O以除去10% bleach。
      2. 分配DMEM完全培养液。
         将standard cassette的另一端转移至含DPBS的容器中Prime 50 mL DPBS 后，转移standard cassette的另一端至装有DMEM完全培养液的容器中Prime少量体积后，向96孔板（Corning.3879）的2-11列中每孔加入100 μL培养液，之后向96孔板的第一列及第12列中加入含2%DMSO的DMEM完全培养液。
      3. 化合物50倍稀释
         应用Bravo自动移液工作站，从96孔化合物母液板中的2-11列中吸取2 μL化合物转移到含100 μLDMEM完全培养液的工作板中，以30 μL的体积吹打混匀10次。
         
   2. 化合物2倍稀释
      应用Bravo自动移液工作站，从50倍稀释后的化合物板中吸取30 μL液体整板转移至细胞板中。
   3. 将化合物处理过的细胞板800 rpm 离心1 min，置于37 °C培养箱中。
      
      
      
4. 细胞培养及IncuCyte 拍照检测
   将化合物处理过的384孔细胞板放入 IncuCyte的放置微孔板的卡槽中，每两小时拍照一次，检测荧光的表达，37 °C培养42h，具体参数见图3 - 4所示：
   
   
   图3. IncuCyte拍照参数设置方法
   
   Tray Type：选择载体类型，如微孔板、载玻片
   Vessel Type：选择孔板类型，如384 well plate
   Scan Type：选择拍照参数类型，如fluorescence&Phase contrast
   Scan Pattern：选择微孔板需拍照的范围
   Set Timeline Scan Intervals：选择拍照开始时间以及间隔时间
   设置好各参数一定点击Apply进行确认并开始。
   
   
   图4. IncuCyte拍照Scan Pattern 设置方法
   
   Scan Pattern的设置：点击主界面左下角Edit Scan Pattrens，在弹出界面点击New新建一个拍照模式并命名，在右边选择要拍照的范围后点击Save保存。在主界面Scan pattern下拉菜单中选择刚刚新建的拍照模式。
   
   
5. 细胞核染色
   实验中Hoechst 33342 的稀释比例为1:1000，Propidium Iodide的稀释比例为1:500，每孔加入20 μL稀释后的染料，一块384孔板需准备25 mL稀释后的染料。
   1. 准备Multidrop（需在超净台中操作）
      Multidrop 安装好standard cassette后，先将standard cassette的进液端放入含10% bleach的容器中prime 50 mL bleach，之后将standard cassette的管路在充满10% bleach的状态下浸泡5 min，随后将standard cassette的进液端转移至含ddH₂O的容器中prime 200 mL ddH₂O以除去10% bleach。
   2. 染料准备
      取一只50 mL离心管用铝箔纸包裹避光，加入25 mL DPBS后向其中加入100 μL Hoechst 33342和200 μL Propidium Iodide，上下颠倒混合均匀，配制的时候注意避光。
   3. 细胞染色
      将standard cassette的另一端转移至含DPBS的容器中Prime 50 mL DPBS 后，转移standard cassette的另一端至装有稀释后染料的离心管中Prime少量体积后，向细胞培养板中整板加入20 μL染料稀释液。细胞板800 rpm 离心1min，置于37 °C培养箱中孵育10min。
      
      
      
6. Operretta 拍照检测
   染色后的细胞板置于Operretta高内涵细胞分析仪中进行拍照分析，激光通道为：EGFP（460nm-490nm）、HOECHST33342（360nm-400nm）、Propidium Iodide（520nm-550nm）。
   

实验注意要点

1. 在使用Multidrop Combi自动分液器前注意观察各个分液头液体的分液速度是否相同，是否存在分液头堵塞的现象，最好每次使用前对每个分液头进行反冲，以确保分液头的通畅。
2. 应用移液工作站向细胞板中加化合物时，打液高度应在液面下1-2 mm，打液速度要慢，防止打液位置的细胞被吹开。
   

结果与分析

1. IncuCyte 结果分析
   IncuCyte拍照的结果应用IncuCyte 2011A软件进行分析：
   分析参数的设置如图5所示：
   
   
   图5. IncuCyte分析方法设置方法
   
   红色框为可调节参数，根据具体实验设置合适的分析方法，然后点击Lanch new analysis对所有图像进行分析。上方出现绿色提示表明已经完成对实验结果的分析。
   左下方红色圈中Preview using current image为预览该分析方法产生的分析结果；Lanch new analysis为应用此分析方法分析微孔板所有孔的图像；Save analysis parameters为保存此分析方法。
   软件分析结束后，将Confluence和object summed intensity per mm2两个参数以96孔板排列的方式导出。导出操作如下（图6）：
   
   
   图6. IncuCyte分析结果导出参数设置方法
   
   点击Graph/Export，在弹出界面选择所需参数，不同时间点的图像分析，然后点击Data Export，选择导出数据的排列方式以及储存路径后点击Export。
   每孔的平均荧光强度（X_sample）=(object summed intensity per mm2)/Confluence
   将所有阳性对照孔的平均荧光强度求平均数，记为X_positive。
   每个化合物的荧光抑制率（%）=100-X_sample/X_positive×100
   设定某阈值如抑制率大于50%作为阳性化合物的标准，则通过计算每个化合物的荧光抑制率，即可挑选出阳性化合物分子。
2. Operetta 结果分析
   Operetta拍照的结果应用Harmony软件进行分析：
   分析参数的设置如图7所示：
   
   
   图7. Operetta分析参数设置方法
   
   红色框为可调节参数，根据具体实验设置合适的分析方法。
   软件分析结束后，将Normalization fluorescent intensity参数以96孔板排列的方式导出。
   将所有阳性对照孔的平均荧光强度求平均数，记为X_positive。
   每个化合物的荧光抑制率（%）=100-X_sample/X_positive×100
   设定某阈值如抑制率大于50%作为阳性化合物的标准，则通过计算每个化合物的荧光抑制率，即可挑选出阳性化合物分子。
   

溶液配方

1. DMEM完全培养基：
   DMEM高糖培养基 + 10%胎牛血清
   

致谢

本课题得到了国家科技部（2014CB910601）、国家自然科学基金（31400796、31401206、31630044、31501111）、中国科学院青年创新促进会，上海市科学技术委员会（14XD1404200）的资助。
感谢中国科学院分子细胞科学卓越创新中心化学生物学平台提供的技术支持和指导。

参考文献

1. Yue, L., Li, L., Li, D., Yang, Z., Han, S., Chen, M., Lan, S., Xu, X. and Hui, L. (2017). High-throughput screening for Survivin and Borealin interaction inhibitors in hepatocellular carcinoma.Biochem Biophys Res Commun 484(3): 642-647.
2. Miller, K. E., Kim, Y., Huh, W. K. and Park, H. O. (2015). Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) Analysis: Advances and Recent Applications for Genome-Wide Interaction Studies. J Mol Biol 427(11): 2039-2055.