siRNA文库筛选细胞活力调控因子---CellTiter-Glo法
siRNA Library Screening of Regulatory Factors of Cell Viability—CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay   

材料与试剂

1. DMEM培养基（元培生物，货号：L110KJ，4℃保存）
2. 1 x PBS
3. OPTI-MEM（Gibco，货号：31985-070）
4. 0.25%胰酶（Gibco，货号：25200-072）
5. 细胞计数板
6. 84消毒液
7. 灭菌双蒸水
8. Lipofectamine RNAiMax（Invitrogen，货号：13778-100，4℃保存，不可以冻存）
9. DharmaFECT 1（GE，货号：T-2001-03）
10. Negative control siRNA （NC，Dharmacon, 货号：D-001810-10-05)
    TOX Transfection Control （ Dharmacon，货号：D-001500-01-05）
11. 5x siRNA Buffer （Dharmacon，货号：B-002000-UB）
12. RNase-free water （Qiagen，货号：129117）
13. CellTiter-Glo（Promega，货号：G756A，-20℃保存）
14. 96孔板（Corning，货号：3610）
15. 0.22 μm 滤器
16. 60 ml注射器
    

仪器设备

1. 37℃ 5% CO₂细胞培养箱
2. 细胞计数仪
3. 自动分液器（Thermo，仪器型号：Multidrop Combi）
4. 水平离心机（Eppendorf，仪器型号：5810R）
5. 多功能微孔板检测仪（PerkinElmer，仪器型号：Ensight）
6. 多标记微孔板检测仪（PerkinElmer，仪器型号：Envision）
7. 排枪，移液枪，移液器（Eppendorf）
   

实验步骤

       本课题工作通过前期探索性实验以及测序分析得到一些可能参与调控细胞增殖及存活的候选基因，以HCT116细胞为研究对象，我们对其中的一部分基因用siRNA文库转染的方法进行敲减，一定时间以后通过检测CTG读值变化分析候选基因是否影响细胞生长。由于候选基因数量不多（<100个），且除了最后收集CTG数据外还希望获取整个实验过程中的细胞生长曲线，因此本实验选用96孔板进行siRNA文库筛选实验。

1. 筛选体系建立及优化
   为建立最优的筛选实验体系，我们测试并优化了多种实验条件，主要包括：细胞接种密度、CTG检测阈值、CTG用量、siRNA转染试剂及用量。
   
   1.1

   CTG检测阈值摸索
         我们将HCT116细胞消化后按照不同细胞接种数铺至96孔板，连续培养4天，每天用Ensight成像并分析细胞密度，第4天实验结束后加入CTG 使用Envision检测细胞活力。以第4天时细胞密度达到80%左右作为最理想条件，不能长至接触抑制。具体的实验步骤如下：
   

   1)

   用0.25%胰酶消化HCT116细胞，加一定量的DMEM培养基进行重悬，吹打均匀后取10μl用细胞计数仪进行计数。（注：细胞计数仪的精确范围一般在5x10⁵-1x10⁶个细胞/ml，对于HCT116细胞，一盘长满的6 cm dish用5 ml培养基重悬，一盘长满的10 cm dish用11 ml DMEM培养基重悬比较合适）

   2)

   设置每孔1000，2500，5000，10000，20000，30000，40000和50000八个细胞接种梯度。根据细胞计数结果计算加入相应数量的细胞，每个孔加100 μl DMEM培养基，每种细胞数条件设置8个复孔，具体实验设计如下图1。

   3)

   细胞铺好贴壁后（<16h，尽量在细胞贴壁但没有开始大量增殖的状态下开始检测）在显微镜明场下观察细胞密度，再用Multidrop往每个孔中加入提前制备好的CTG溶液，其中4个复孔按照1：2（CTG：培养基）每孔加50 μl CTG(培养基:CTG=2:1)，另4个复孔按1:1（CTG：培养基）每孔加100 μl CTG。

   4)

   水平离心机800-1000 rpm室温离心1 min后，避光静置反应10 min， Envision仪器设置程序检测CTG值。

   5)

   分析数据，确定最适细胞接种数及CTG用量。
   
   
   图1. CTG检测阈值实验设计
   
   
   1.2

   siRNA转染条件优化
         我们比较了RNAiMax和DharmaFECT 1两种转染试剂，通过设置合适的阳性对照和阴性对照，我们需要确定在CTG检测阈值内转染毒性较低且转染效率较高的转染试剂类型以及该转染试剂的用量和起始转染细胞数量。为了检测转染试剂的毒性，我们以NC作为实验组；检测转染试剂效率，我们以TOX transfection control siRNA作为阳性对照实验组。我们用反式转染（Reverse Transfection）方法进行转染，具体的实验步骤如下。
   

   1)

   NC和TOX siRNA的储存浓度为20 μM，用1 x siRNA Buffer按1:100稀释成200 nM，每个孔加10 μl稀释后的siRNA。

   2)

   依据转染试剂说明书计算，两种转染试剂分别设三个剂量，分别是每孔0.1 μl，0.15 μl和0.2 μl，转染试剂溶解在30 μl OPTI-MEM里。根据CTG预实验结果，在检测阈值内我们设置了每孔1000，1500，2000和2500四个初始转染细胞量。设置只加OPTI-MEM和siRNA稀释缓冲液作为比较细胞毒性的对照，NC组与未加转染试剂的对照组比死亡率较低的则说明毒性较小，TOX组与NC组比细胞死亡更多的则说明转染效率较高。每个条件各三个复孔即三块平行板，每块板的具体转染分布设计如下图：
   
   
   图2. siRNA转染试剂条件优化预实验设计
   
   

   3)

   由于预实验条件设置较多，因此我们用排枪手动加样。将上述准备好的siRNA按上图中设计加入相应的孔中，每孔10 μl，再把转染试剂也用30 μl OPTI-MEM配好加入相应的siRNA中。

   4)

   用水平离心机5810R将混合好的siRNA和转染试剂800 rpm离心1-2 min，室温静置20 min（静置的过程中准备细胞悬液，静置时间可以延长至1 h都影响不大）。

   5)

   准备细胞悬液
   

   1. 用0.25%的胰酶37 ℃细胞培养箱中消化一盘基本长满的HCT116细胞2 min，加DMEM培养基中和反应，用离心机5810R 1000 rpm离心1 min弃去上清消除胰酶，再加10 ml DMEM培养基重悬，用细胞计数仪计数得到活细胞浓度。将细胞稀释成1000/1500/2000/2500个细胞/100 μl DMEM完全培养基的悬液。
   2. 用自动化分液仪Multidrop Combi将上述细胞悬液加入图1设计的siRNA板相对应的列，100 μl/孔。
   3. 将加好转染试剂和细胞的96孔板放置于CO₂培养箱中培养（加入细胞后尽量不用离心，让细胞自然沉降以提高转染效率）。
   4. 转染后的四天每天于固定时间用Ensight拍照观察细胞数，第四天拍照结束后加CTG检测分析细胞存活情况，分析数据确定合适的转染条件。
2. siRNA库筛选正式实验
         我们根据前期测序结果挑选出若干候选基因，每个基因4条不同的siRNA，每条siRNA设置3个复孔。具体的实验步骤如下。
   
   2.1

   由自动化液体工作站制备好siRNA文库板，每个孔10 μl siRNA（200nM）。将板子全部摊开在超净台中室温放置5-10 min使siRNA溶解，注意不能把板子摞在一起，否则会由于板子上下温度不一样而造成液体蒸发至封板膜上。再用水平离心机5810R 2000 rpm离心1 min将siRNA甩至板底。
   2.2

   用1x siRNA Buffer溶解稀释阴性对照NC和阳性对照siTOX，稀释方法与预实验相同，使浓度与96孔板中目的基因的siRNA一致。每块板都必需设置4-5个复孔的NC和siTOX。
   2.3

   根据预实验优化的转染条件计算需要的转染试剂的量，每个孔用30 μl OPTI-MEM稀释转染试剂。再用自动化分液仪 Multidrop Combi将配好的转染试剂溶液加到每个siRNA孔中。用细头的分液盒加转染试剂（量程为0.5-50 μl），装好后默认匹配的是384孔板，需要更改设置调成96孔板，速度用低速（low）。
   2.4

   转染试剂加完后用水平离心机5810R 800 rpm离心1-2 min将转染试剂和siRNA混匀，室温静置20 min，此时可以准备细胞，时间可以延长至1 h。
   2.5

   与预实验方法相同准备HCT116细胞悬液，用粗头的分液盒加细胞，每孔100 μl，速度设为低速，每孔细胞数根据预实验优化的条件加。
   2.6

   将加好转染试剂和细胞的96孔板放置于5% CO₂培养箱中培养（加入细胞后尽量不用离心，让细胞自然沉降以提高转染效率），转染完成细胞贴壁后第二天即可进行后续相关检测实验。
   2.7

   转染后的四天每天于固定时间用Ensight观察细胞数，第四天成像结束后加入CTG检测分析细胞存活情况，分析数据筛选出对生长有影响的候选基因

结果与分析

1. CTG检测阈值
         依据上述实验步骤进行完实验后，对实验数据进行分析，结果如图2所示。在96孔板中铺8个不同量的HCT116细胞，贴壁后第二天在显微镜下观察显示20000个左右细胞的密度在80%左右，而30000以上的细胞就基本长满已经有接触抑制了。从CTG曲线可以看出，20000个细胞也在CTG检测的线性范围内，且100 μl培养基中加50 μl和100 μl CTG效果基本一致，50 μl稍微敏感一些。正式实验时我们打算培养96 h，因此推算出起始细胞量在1000-2500之间比较合适，CTG的检测加50 μl即可。
   
   
   图3. CTG检测阈值结果
   
   
2. siRNA转染条件优化
         根据预实验设计，两种转染试剂RNAiMax和DharmaFECT 1各三种不同的用量0.1，0.15和0.2 μl/孔，在CTG检测阈值范围内起始细胞数设置1000、1500、2000和2500个/孔四个条件。
         siRNA转染HCT116后培养96 h测出的CTG曲线如下图3到图6。图3和图4是将转染NC对照组和只加1 x siRNA稀释缓冲液的对照组在不同实验条件下的CTG值进行比较分析两种转染试剂对HCT116细胞的毒性，CTG曲线结果表明转染试剂的用量越多，细胞毒性越高。图5和图6是将转染siTOX实验组和只加1x siRNA稀释缓冲液的对照组在不同实验条件下的CTG值进行比较分析两种转染试剂对HCT116细胞的转染效率，图中结果表明转染试剂的用量越多，转染效率也越高。综合转染毒性和转染效率，以及CTG的线性检测阈值，我们最终确定HCT116细胞96孔板每孔初始细胞量为1500个，0.15 μl/孔 RNAiMax转染试剂，为siRNA转染最优条件。
   
   
   图4. 转染试剂RNAiMax细胞毒性分析
   
   
   图5. 转染试剂DharmaFECT 1细胞毒性分析
   
   
   图6. 转染试剂RNAiMax转染效率分析
   
   
   图7. 转染试剂DharmaFECT 1转染效率分析
   
   
3. 筛选影响细胞生长的基因
         总结分析实验数据，计算每块板的阴性对照NC的CTG数值平均值，再将相应板的每个孔CTG数值除以NC组的平均值得到一组新的数值，TOX的数值越小说明转染实验做的越好。分析归类出与NC有差异的基因，大于1的说明敲低该基因后促进细胞生长，小于1的说明敲低该基因后抑制细胞生长。筛选出候选基因后，后续再用其他实验辅助验证。
   

溶液配方

1. 1 x PBS
   用双蒸水稀释10 x PBS获得
2. 10% 84消毒液
   用双蒸水稀释84原液获得，再用0.22 μm滤器过滤制备
3. DMEM培养基
   500 ml培养基加10% FBS和1%氨苄青霉素/链霉素溶液
4. 灭菌双蒸水
   将双蒸水121 ℃高压灭菌20 min获得
5. siNC/siTOX溶液
   用1 x siRNA Buffer将siRNA储存液稀释100倍，每个孔加10 μl
6. CTG试剂制备
   提前溶解CTG缓冲液并平衡至室温，将冻干状态的CTG底物也置于室温，用CTG缓冲液溶解冻干状态的酶/底物混合物，温和的震荡混匀即配制成CTG试剂
   

注意事项

1. 室温溶解siRNA时不要将孔板摞在一起，否则会由于板子上下温度不一致而导致溶液挥发至封板膜上，不容易被离心至孔内。
2. 自动化分液仪 Multidrop Combi加样时要根据体积选择合适的分液盒，速度设置要合适。由于分液盒长期使用是磨损型耗材，加样前要用移液器确认实际体积与目的体积是否有偏差。另外由于吹打混匀以及管子里需要充盈液体，因此需要比实际需要加样的总体积多配一些溶液，细分液盒至少需要1 ml，粗分液盒至少需要7 ml。
3. 正式筛选实验时，每块siRNA板子都需要设置阴性和阳性对照，数据处理时都是跟同一块板的阴性对照NC比较。
4. Envision的检测对体积有要求，液体不可以太多否则容易溢出污染aperture（信号检测相机的光圈）。运用96孔板进行筛选实验，液体体积在150-200 μl均可。
5. 由于ATP易水解，加入CTG试剂的整个检测实验操作过程中应该特别注意避光。
   

致谢

本工作的顺利开展得益于国家自然科学基金面上项目（资助号：81972260，81772599）的经费支持。实验技术方面得到了中国科学院分子细胞科学卓越创新中心化学生物学技术平台的韩帅老师和慈云青老师的悉心指导。

参考文献

1. Crouch, S. P., Kozlowski, R., Slater, K. J. and Fletcher, J. (1993). The use of ATP bioluminescence as a measure of cell proliferation and cytotoxicity. J Immunol Methods 160(1): 81-8.
2. Kangas, L., Grönroos, M. and Nieminen, A. L. (1984). Bioluminescence of cellular ATP: A new method for evaluating cytotoxic agents in vitro. Med Biol 62(6): 338-43.
3. Cree, I. A., Pazzagli, M., Mini, E., Mazzei, T., Hunter, E. M., Sutherland, L. A., Pinzani, P., Gerli, A. and Andreotti, P. E. (1995). Methotrexate chemosensitivity by ATP luminescence in human leukemia cell lines and in breast cancer primary cultures: Comparison of the TCA-100 assay with a clonogenic assay. Anticancer Drugs 6(3): 398-404.
4. 白志军 和 狄飚. (2015). Celltiter-Glo ATP荧光活性检测在登革病毒1型中和试验中的应用. 江苏预防医学 1(5): 16-8.