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Super-high Molecular Weight DNA Isolation   

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摘要:随着三代测序的快速发展,对微生物超高分子量DNA (SHMW-DNA) 的需求越来越多,三代测序有助于大大提高微生物基因组或宏基因组组装效率。目前,常用的商业试剂盒或液体试剂提取DNA的方法,受纯化膜或液体剪切力的影响,提取的DNA片段约10-30 kb,无法满足SHMW-DNA的质量要求。本方法采用琼脂糖包埋法,通过胶内裂解和电泳洗脱回收方式,获得SHMW-DNA,分子量达到300 kb以上,将为三代测序尤其是nanopore测序提供重要支撑。

关键词: 微生物, 超高分子量DNA, 提取, 三代测序

材料与试剂

  1. 透析袋 (MD34 (8,000-14,000 Da),扁平宽度10 mm)
  2. 0.25 μm滤膜
  3. 溶菌酶
  4. 蛋白酶K (冻干粉,≥ 40 units/mg protein)
  5. MidRange PFG Marker I
  6. Tris
  7. EDTA
  8. 苯甲基磺酰氟
  9. N-月桂酰肌氨酸钠
  10. 脱氧胆酸钠
  11. 硼酸
  12. 冰乙酸
  13. 聚乙二醇8000
  14. 低熔点琼脂糖

仪器设备

  1. 模具 (长 × 宽 × 高约为1 cm × 0.5 cm × 1 cm)
  2. 脉冲场电泳仪
  3. 照胶仪
  4. 恒温烘箱

实验步骤

  1. 取新鲜采集微生物样品,根据样品特点离心获得微生物细胞,用TE缓冲液重悬细胞,利用平板计数法使得细胞的浓度约为每毫升107-108个。
  2. 取3 ml加热溶解的1.6%低熔点琼脂糖,温度降至45 °C左右,加入等体积微生物细胞,混匀后立即加入可制成胶块的模具中,4 °C凝固30 min。
  3. 取出胶块,置于5 倍体积的DNA裂解液中,37 °C静置孵育裂解1 h。
  4. 把胶块转到与裂解液等体积的ESP缓冲液中,于恒温烘箱50 °C裂解48 h,其间更换一次ESP缓冲液。
  5. 取10-20倍胶块体积的冰冷TE缓冲液,加入PMSF贮备液至终浓度0.1 mM,置于冰上洗涤胶块3次,每次静置1 h。
    注:PMSF苯甲基磺酰氟是一种高强度毒性的胆碱酯酶抑制剂。操作时需佩戴合适的手套和安全眼镜,始终在化学通风橱里使用。
  6. 将胶块保存于0.05 M EDTA溶液 (pH 8.0) 中,4 °C保存 (可放置1年)。
  7. 在照胶仪下观察,用刀片切下含DNA条带的胶块,小心塞进透析袋中,加入20-100 μl 0.5x TBE缓冲液,赶出气泡后两端夹紧透析袋夹。
  8. 将透析袋放入含4 °C预冷0.5x TBE缓冲液的脉冲场电泳槽中,设置槽温14 °C、电压6 V/cm、脉冲转换时间25 s、转换角度120 º、电泳时间5 h,将胶块中的DNA电泳至透析袋溶液中。
  9. 电泳结束后,将透析袋在电泳槽中水平调转180 º,再次电泳1.5 min,将透析膜上的DNA电泳至透析袋溶液中。
  10. 取出透析袋,打开一侧的透析袋夹,用剪去尖的枪头,小心缓慢的吸出DNA溶液,置于一个1.5 ml的离心管中。
  11. 用NanoDrop或Qubit对DNA进行定量。
  12. 利用脉冲场电泳仪进行DNA片段大小分布和降解情况分析,设置电泳条件: 1%琼脂糖凝胶,0.5x TBE缓冲液,温度14 °C,泵速80,电场夹角120 º,起始脉冲时间0.1 s,终止脉冲时间40 s,电场强度6 V/cm,电泳时间为16 h。

结果与分析

该方法提取的DNA整体主条带大于300 kb (见图1) (朱雅新,2007;李旦,2009)。


1. 奶牛瘤胃微生物SHWM-DNA脉冲场电泳图

溶液配方

  1. 0.5 M EDTA溶液 (pH 8.0):186.1 g EDTA,20 g NaOH,加水定容至1 L,浓盐酸调pH至8.0。
  2. 0.05 M EDTA溶液 (pH 8.0):取1 ml 0.5 M EDTA溶液,加入9 ml超纯水。
  3. 1 M Tris-HCl:121.1 g Tris碱,42 ml浓盐酸定容至1 L,调pH至8.0。
  4. TE缓冲液 (pH 8.0):10 ml 1 M Tris-HCl (pH 8.0),2 ml 0.5 M EDTA (pH 8.0),加入超纯水定容至1 L。
  5. PMSF (苯甲基磺酰氟) 贮备液:用异丙醇溶解配制100 mM的贮存液,4 °C保存。使用前37 °C加热15 min溶解。
  6. 溶菌酶:用10 mM Tris-Cl (pH 8.0) 溶解溶菌酶,配制成10 mg/mL浓度的储存液。
  7. DNA裂解液:10 mM Tris (pH 8.0),50 mM NaCl,0.1 M EDTA,1% N-月桂酰肌氨酸钠,0.2%脱氧胆酸钠,1 mg/ml 溶菌酶。
  8. ESP缓冲液:1% N-月桂酰肌氨酸钠,1 mg/ml 蛋白酶K,0.5 M EDTA。
  9. 5x TBE储备液:54 g Tris,27.5 g 硼酸,20 ml 0.5 M EDTA (pH 8.0) 加水至1 L。
  10. 0.5x TBE工作液:将5x TBE储备液稀释10倍。
  11. 50x TAE储备液:242 g Tris,57.1 ml 冰乙酸,100 ml 0.5 M EDTA (pH 8.0),加水定容至1 L。
  12. 1x TAE工作液:将50x TAE储备液稀释50倍。
  13. 30%聚乙二醇8000:称取20 g聚乙二醇8000,溶于超纯水中,最后定容到100 ml,0.25 μm滤膜过滤除菌后于4 °C保存。
  14. 1.6%低熔点琼脂糖:1.6 g低熔点琼脂糖,加入100 ml超纯水中。

致谢

感谢中国农业科学院创新工程 (ASTIP-IAS12) 支持,感谢中国农业科学院北京畜牧兽医研究所金迪、刘思佳、李旦、朱雅新等研究生的帮助。采用本实验方法发表的文章如下:朱雅新,东秀珠,黄力,董志扬. (2007). 瘤胃元基因组BAC文库研究. 中国农业科技导报 009(005): 53-57. 李旦,王加启,卜登攀,刘开朗,李发弟. (2009). 荷斯坦奶牛瘤胃微生物元基因组Fosmid文库的构建与分析. 微生物学杂志 29(06): 1-4.

参考文献

  1. 朱雅新,东秀珠,黄力,董志扬. (2007). 瘤胃元基因组BAC文库研究.中国农业科技导报 009(005): 53-57.
  2. 李旦,王加启,卜登攀,刘开朗,李发弟. (2009). 荷斯坦奶牛瘤胃微生物元基因组Fosmid文库的构建与分析. 微生物学杂志29(06): 1-4.
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Copyright: © 2021 The Authors; exclusive licensee Bio-protocol LLC.
引用格式:赵圣国. (2021). 微生物超高分子量DNA提取方法. Bio-101: e2103997. DOI: 10.21769/BioProtoc.2103997.
How to cite: Zhao, S. G. (2021). Super-high Molecular Weight DNA Isolation. Bio-101: e2103997. DOI: 10.21769/BioProtoc.2103997.
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