摘要:细胞内融合基因技术是一项结合了单细胞分离、融合PCR、巢式PCR和测序技术的新型分子技术,不仅可以在未培养的单细胞中将功能基因与系统发育标记基因 (如16S rRNA基因) 连接在一起,而且通量高,成本低。该技术首先通过稀释和涡旋将样品分散成单细胞体系,然后对拟研究的系统发育基因和功能基因进行融合扩增,随后进行巢式PCR,建库并进行高通量测序。细胞内融合基因技术既能够解决扩增子测序物种信息与功能信息脱节的困境,又能够克服大规模宏基因组测序成本高、分析难且研究对象仅是优势物种的局限。
关键词: 细胞内融合基因技术, 功能基因, 融合PCR, 巢式PCR
材料与试剂
一、生成聚丙烯酰胺凝珠
- 5 ml、2 ml、50 ml离心管
- PCR小管
- 35 μm细胞筛
- 0.2 μm滤膜
- 各种型号移液枪头
- 双蒸水
- 过硫酸铵 (St. Louis, MO, USA, Sigma, catalog number: A3678)
- N,N'-双 (丙烯酰) 胱胺BAC (St. Louis, MO, USA, Sigma)
- 丙烯酰胺 (St. Louis, MO, USA, Sigma)
- Tris-HCl (pH 7.5)
- 氯化钾
- 矿物油 (St. Louis, MO, USA, Sigma, catalog number: M8410)
- 司盘80 (St. Louis, MO, USA, Sigma, catalog number: 85548)
- 吐温80 (St. Louis, MO, USA, Sigma, catalog number: P8192)
- 四甲基乙二胺 (TEMED) (St. Louis, MO, USA, Sigma)
- 二乙醚 (St. Louis, MO, USA, Sigma)
- 蛋白酶K (St. Louis, MO, USA, Sigma)
- 溶菌酶 (St. Louis, MO, USA, Sigma)
二、融合PCR
- 2 mm玻璃珠
- 2 ml小管
- 各种型号移液枪头
- PCR小管
- ABIL EM 90
- Triton X-100
- 矿物油 (St. Louis, MO, USA, Sigma, catalog number: M8410)
- 双蒸水
- 5x Phusion HF 缓冲液
- 超保真酶Phusion Hot Start Flex DNA Polymerase (NEB)
- 50 mM MgCl2
- 10 mM dNTPs
- 正向引物F1
- 反向引物R2
- 融合引物F2-R1
- 牛血清白蛋白BSA (molecular biology grade, NEB, Ipswich, MA, USA)
- 吐温20 (St. Louis, MO, USA, Sigma)
- 乙二胺四乙酸EDTA (St. Louis, MO, USA, Sigma)
三、破乳化释放聚丙烯酰胺凝珠
- 1.5 ml、2 ml、50 ml离心管
- 各种型号移液枪头
- 双蒸水
- 二乙醚 (St. Louis, MO, USA, Sigma)
- 乙酸乙酯 (St. Louis, MO, USA, Sigma)
- AMPure XP磁珠 (Beckman Coulter, Danvers, MA, USA)
- 无水乙醇
四、巢式PCR
- 1.5 ml、2 ml、50 ml离心管
- PCR小管
- 各种型号移液枪头
- 双蒸水
- 超保真酶Phusion Hot Start Flex DNA Polymerase (NEB)
- 5x Phusion HF 缓冲液
- 50 mM MgCl2
- 10 mM dNTPs
- 正向引物F3
- 反向引物R3
- 阻断引物blockF
- 阻断引物blockR
- SYBR Green I 核酸染色试剂盒 (10,000x, Invitrogen, Waltham, MA, USA)
表1. 本项目中融合硫酸盐还原菌的功能基因dsrB和16S rRNA所使用的引物信息
引物名称 | 引物序列 (5’-3’) |
F1 (dsrB-F1) | GTGTAGCAGTTACCGCA |
R1-F2 (dsrB-R1_519R) | GWATTACCGCGGCKGCTGTGCCTSAAYATGTGYGGYG |
R2 (1492) | GGTTACCTTGTTACGACTT |
F3 (dsrB-F3) | VAGVATSGCGATRTCGGA |
R3 (E786R) | GGACTACHVGGGTWTCTAAT |
BlockR (U519R-block10) | TTTTTTTTTTGWATTACCGCGGCKGCTG/3SpC3/ |
BlockF (U519F-block10) | TTTTTTTTTTCAGCMGCCGCGGTAATWC/3SpC3/ |
仪器设备
一、生成聚丙烯酰胺凝珠
- 1.5 ml台式高速离心机
- 各种型号移液枪
- 涡旋仪
- 超声波清洗仪
- 超净操作台
- 通风橱
二、融合PCR
- 超净操作台
- 涡旋仪
- PCR仪
- PCR管离心仪
- 1.5 ml台式高速离心机
三、破乳化释放聚丙烯酰胺凝珠
- 1.5 ml台式高速离心机
- 各种型号移液枪
- 通风橱
- 磁珠清洗磁力架
- 超净工作台
四、破乳化释放聚丙烯酰胺凝珠
- PCR仪
- qPCR仪
- 超净操作台
- 各种型号移液枪
- PCR管离心仪
实验步骤
一、生成聚丙烯酰胺凝珠
- 细胞悬浮液准备
通过ATP等方法对样品细胞悬浮液的浓度进行定量检测,稀释得到30 μl包含1,400万个细胞的样品悬浮液。 - 制备聚丙烯酰胺凝珠
- 二乙醚提取聚丙烯酰胺凝珠
- 细胞溶解 (可选)
添加0.8%的溶菌酶 (35,000 U/µl),于37 °C过夜培养。离心,移除上清;重悬浮在1x TK缓冲液中。用20%蛋白酶K (1 mg/ml) 和0.8% TritonX-100处理,37 °C培养30 min,然后95 °C培养10 min,重悬浮在1x TK缓冲液中。
二、融合PCR
- 配制PCR反应混合体系,各组分的体积为1.1倍样品数。
- 每个样各分装55.2 μl混合液到2 ml 离心管中,加入45 μl合成的聚丙烯酰胺凝珠,混合均匀。加入900 μl ABIL油,3,000 rpm涡旋1 min,充分振荡混匀。
- 分装60 μl反应混合液到PCR小管中,每个样约分装16管。然后进行PCR:94 °C 30 s, [94 °C 5 s, 52 °C 30 s, 72 °C 30 s] 33个循环, 72 °C 5 min, 4 °C ∞。
- 反应结束后,立马将融合产物收集到1.5 ml离心管中 (将融合产物跑电泳,通常看不到任何产物条带,如图2所示)。在每个收集的样品中,加入终浓度为1 mM的EDTA,该样品可在4 °C保存过夜。
图2. 融合PCR后产物跑胶图
三、破乳化释放聚丙烯酰胺凝珠
- 破坏ABIL乳化体系,释放凝珠
- 磁珠清洗PCR产物
四、巢式PCR
- 巢式qPCR (可选)
- 巢式PCR
- 将同一样品的平行样收集到1.5 ml离心管中,可以先用5 μl样品跑水平凝胶电泳,观察生成目标产物情况。若生成目标产物,将样品跑胶然后割胶纯化,再用磁珠清洗 (方法同阶段三步骤2),最后送测序。
结果与分析
本课题组采用细胞内融合基因技术 (epicPCR) 对采集自十个西藏盐湖底泥的硫酸盐还原菌群落的系统分类和多样性进行了鉴定,并对影响该群落结构的环境因子进行了鉴别。研究发现了十个新的硫酸盐还原菌门,并由此表明,环境中尚有大量的未知硫酸盐还原菌群类别。可参见如下结果:
- 通过对融合的16S rRNA加dsrB基因的16S rRNA扩增子和epicPCR产物的测序,共检测到10个湖泊的微生物总群落的12,519个OTU和硫酸盐还原菌群的883个SRP OTUs (表2)。在微生物总群落和硫酸盐还原菌类群中,变形杆菌、厚壁菌和拟杆菌是最主要的门,包括了最大比例的OTUs代表 (图3)。整个微生物群落和SRP亚群落的α-多样性呈显著正相关 (R2 = 0.443,P < 0.05),β-多样性部分重叠 (图4),揭示了两者间的关系。
表2. 对西藏盐湖中微生物总群落和硫酸盐还原菌群落的门,属,以及OTUs水平的结构比较
图3. 微生物总群落和硫酸盐还原菌群落的OTUs的门的水平分类。外饼为微生物总群落,内饼为硫酸盐还原菌群落。
图4. 微生物总群落和硫酸盐还原菌的α-多样性 (a) 与β-多样性 (b) 的对比
- 按照epicPCR最初创始文章的方法,筛选出了120个高丰度的SRP-OTU (至少一个样本中为1%),并对其构建了进化树以观察进化分化 (图5)。这些高丰度的SRP-OTU与17个描述的门相关,其中只有7个广为认可的SRP门。类似于微生物总群落的大多数OTUs,大多数SRP-OTUs只存在于某个特定的湖泊中, 证明了在西藏盐湖中微生物群落和SRP亚群落的分布的地方特殊性。
图5. 120个高丰度的硫酸盐还原菌的OTUs的进化关系。加黑字体为参考序列,蓝色字体为广泛分布的OTUs (每一个湖中均有高丰度存在),黑色字体为只以高丰度存在于某一个湖中的OTUs,红色字体为高丰度存在于两个以上的湖,但并不在每个湖中都有的OTUs。进化枝上蓝色圆形大小表示自展值的大小 (70-100)。红色进化枝代表属于新发现的十个硫酸盐还原菌门的OTUs (图下方 * 标记的菌门)。黑色柱形代表该OTUs相对丰度最高的湖中的丰度。彩色条形标记门的水平的分类。
溶液配方
- 丙烯酰胺溶液
12% 丙烯酰胺
0.32% BAC
- 1x TK 缓冲液
20 mM Tris HCl
60 mM KCl
- STT 乳化油 (14天内可用,每次使用前需要颠倒混匀)
4.5% 司盘80
0.4% 吐温80
0.05% Triton X-100
v/v溶于矿物油中
- ABIL 乳化油 (常温储存)
4% ABIL EM90
0.05% Triton X-100
v/v溶于矿物油中
致谢
感谢自然科学基金重大研究计划培育项目 (项目号91851106) 以及国家自然科学基金青年基金项目 (项目号32001092) 的经费支持!感谢MIT研究团队Spencer等人,该实验方案参考自Spencer等人于2016年发表在ISME Journl上的文章以及他们提供的详细的实验流程,在此表示特别感谢!
参考文献
- Spencer S J, Tamminen M V, Preheim S P, Guo M T, Briggs A W, Brito I L, D A W, Pitkanen L K, Vigneault F, Juhani Virta M P, Alm E J. (2016). Massively parallel sequencing of single cells by epicPCR links functional genes with phylogenetic markers. ISME J, 10: 427-436.
- Qin H, Wang S, Feng K, He Z, Virta M P J, Hou W, Dong H, Deng Y. (2019). Unraveling the diversity of sedimentary sulfate-reducing prokaryotes (SRP) across Tibetan saline lakes using epicPCR. Microbiome, 7: 71.
Please login or register for free to view full text
View full text
Download PDF
Q&A
Copyright: © 2021 The Authors; exclusive licensee Bio-protocol LLC.
引用格式:沈文丽, 王尚, 邓晔. (2021). 细胞内融合基因技术 (epicPCR) 测定功能类群多样性. // 微生物组实验手册.
Bio-101: e2003724. DOI:
10.21769/BioProtoc.2003724.
How to cite: Shen, W. L., Wang, S. and Deng, Y. (2021). Diversity of Functional Microbes Detected by epicPCR Technology. // Microbiome Protocols eBook.
Bio-101: e2003724. DOI:
10.21769/BioProtoc.2003724.