材料与试剂

一、生成聚丙烯酰胺凝珠

1. 5 ml、2 ml、50 ml离心管
2. PCR小管
3. 35 μm细胞筛
4. 0.2 μm滤膜
5. 各种型号移液枪头
6. 双蒸水
7. 过硫酸铵 (St. Louis, MO, USA, Sigma, catalog number: A3678)
8. N,N'-双 (丙烯酰) 胱胺BAC (St. Louis, MO, USA, Sigma)
9. 丙烯酰胺 (St. Louis, MO, USA, Sigma)
10. Tris-HCl (pH 7.5)
11.  氯化钾
12. 矿物油 (St. Louis, MO, USA, Sigma, catalog number: M8410)
13. 司盘80 (St. Louis, MO, USA, Sigma, catalog number: 85548)
14. 吐温80 (St. Louis, MO, USA, Sigma, catalog number: P8192)
15. 四甲基乙二胺 (TEMED) (St. Louis, MO, USA, Sigma)
16. 二乙醚 (St. Louis, MO, USA, Sigma)
17. 蛋白酶K (St. Louis, MO, USA, Sigma)
18. 溶菌酶 (St. Louis, MO, USA, Sigma)
    
    

二、融合PCR

1. 2 mm玻璃珠
2. 2 ml小管
3. 各种型号移液枪头
4. PCR小管
5. ABIL EM 90
6. Triton X-100
7. 矿物油 (St. Louis, MO, USA, Sigma, catalog number: M8410)
8. 双蒸水
9. 5x Phusion HF 缓冲液
10. 超保真酶Phusion Hot Start Flex DNA Polymerase (NEB)
11. 50 mM MgCl₂
12. 10 mM dNTPs
13. 正向引物F1
14. 反向引物R2
15. 融合引物F2-R1
16. 牛血清白蛋白BSA (molecular biology grade, NEB, Ipswich, MA, USA)
17. 吐温20 (St. Louis, MO, USA, Sigma)
18. 乙二胺四乙酸EDTA (St. Louis, MO, USA, Sigma)
    
    

三、破乳化释放聚丙烯酰胺凝珠

1. 1.5 ml、2 ml、50 ml离心管
2. 各种型号移液枪头
3. 双蒸水
4. 二乙醚 (St. Louis, MO, USA, Sigma)
5. 乙酸乙酯 (St. Louis, MO, USA, Sigma)
6. AMPure XP磁珠 (Beckman Coulter, Danvers, MA, USA)
7. 无水乙醇
   
   

四、巢式PCR

1. 1.5 ml、2 ml、50 ml离心管
2. PCR小管
3. 各种型号移液枪头
4. 双蒸水
5. 超保真酶Phusion Hot Start Flex DNA Polymerase (NEB)
6. 5x Phusion HF 缓冲液
7. 50 mM MgCl2
8. 10 mM dNTPs
9. 正向引物F3
10. 反向引物R3
11. 阻断引物blockF
12. 阻断引物blockR
13. SYBR Green I 核酸染色试剂盒 (10,000x, Invitrogen, Waltham, MA, USA)
    
    表1. 本项目中融合硫酸盐还原菌的功能基因dsrB和16S rRNA所使用的引物信息
    

仪器设备

一、生成聚丙烯酰胺凝珠

1. 1.5 ml台式高速离心机
2. 各种型号移液枪
3. 涡旋仪
4. 超声波清洗仪
5. 超净操作台
6. 通风橱
   
   

二、融合PCR

1. 超净操作台
2. 涡旋仪
3. PCR仪
4. PCR管离心仪
5. 1.5 ml台式高速离心机
   
   

三、破乳化释放聚丙烯酰胺凝珠

1. 1.5 ml台式高速离心机
2. 各种型号移液枪
3. 通风橱
4. 磁珠清洗磁力架
5. 超净工作台
   
   

四、破乳化释放聚丙烯酰胺凝珠

1. PCR仪
2. qPCR仪
3. 超净操作台
4. 各种型号移液枪
5. PCR管离心仪
   

实验步骤