摘要:根系分泌物是植物根向生长基质中释放有机物总称,已有研究表明,根系分泌物对根际微生物生长以及功能的发挥具有至关重要的作用。但对于根系分泌物中某一类型物质对根际土著微生物群落结构的影响尚不得知。为此,本方法选取48种来自于番茄根系分泌物或组织的资源,包括糖类、有机酸、酚酸、氨基酸。利用这48种资源进行不同多样性的组合,模拟不同组分的根系分泌物。将各根系分泌物组合外源添加到土壤中,模拟根系分泌物对微生物的调控,探究根系分泌物对土壤土著微生物群落组成及其功能 (如抑制病原菌入侵) 的影响。该方法可为室内或微宇宙条件下定量研究根系分泌物的调控作用提供技术支撑。
关键词: 根系分泌物, 土壤微生物群落, 土传青枯菌, 资源调控
材料与试剂
一、 耗材
二、 供试菌株
野生型茄科劳尔氏菌Ralstonia solanacearum QL-Rs1115 (GenBank accession GU390462,以下简称青枯菌) 为本实验室于南京市麒麟后村发病番茄植株中分离而得,具有强的致病性 (Wei et al., 2011)。
三、 化学试剂
四、 培养基与缓冲液 (见溶液配方)
五、 植物与育苗基质
仪器设备
软件和数据库
实验步骤
一、供试土壤的准备
二、模拟根系分泌物的制备与添加
三、土壤DNA提取以及青枯菌定量PCR
四、16S rRNA基因扩增及测序
采用引物563F (5’-AYTGGGYDTAAAGVG-3’) 和802R (5’-TACNVGGGTATCTAATCC-3’) (Cardenas et al., 2010) 对细菌16S rRNA基因V4高变区进行PCR扩增,PCR体系 (20 µl) 为4 µl 5x FastPfu buffer, 2 µl 2.5 mM dNTPs, 0.4 µl引物 (5 µM) , 0.5 µl DNA 模板和0.4 µl FastPfu DNA聚合酶 (TransGen Biotech, Beijing, China)。PCR包含30个循环条件为:95 °C 30 s预变性,55 °C退火30 s,72 °C 延伸30 s。扩增产物先用AxyPrep PCR Clean-up Kit (Axygen Biosciences, Union City, CA, USA) 纯化,然后进行琼脂糖凝胶电泳。纯化后的扩增产物用QuantiFluorTM-ST (Promega, WI, USA) 定量后,送至上海美吉生物公司进行双向250 bp Miseq测序。
五、序列处理 扩增子测序结果降噪采用UPARSE 标准处理流程,首先将同一样品的正反向序列对进行拼接、去除低质量核苷酸 (最大错误率0.25) 以及长度低于200 bp的序列,并删除单序列 (singleton),然后将序列按97%相似性进行操作分类单元 (Operational taxonomic unit, OTU) 分配并去除嵌合体。利用Mothur软件 (Schloss et al., 2009) 对UPARSE处理获得的代表序列和OTU表进行后续分析。测序深度统一至序列数最少的样品的测序量,OTU的分类地位经RDP 16S rRNA classifier比对获得,置信度阈值设为80%。 六、温室盆栽试验
溶液配方
致谢
本研究由国家重点研发计划 (2018YFD1000800)、国家自然科学基金 (41471213, 31801952, 41922053)、江苏省自然科学基金 (BK20181068, BK20170085) 资助。本实验流程基于已发表的论文 (Gu et al., 2017; Gu et al., 2020) 撰写。
参考文献
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