DNA-Stable Isotope Probing and Metagenomics Binning   

基本原理

1. 稳定同位素示踪原理
   在碳同化培养体系中添加含¹³C的标记物与微生物共培养。该过程中微生物如果可以利用标记物进行同化作用，则可将¹³C合并至自身DNA，从而完成对目标功能菌群的“标记”。然后收集样品总DNA，利用超速离心机分离。由于浮力密度的不同，¹³C-DNA主要分布在底层（重层），未被标记的¹²C-DNA则主要分布在上层（轻层）（图1）。重点收集重层DNA进行下游的高通量测序及生物信息学分析（图2）。
   
   
   图1 DNA-SIP分层示意图。 (图片来自网络)
   
   
   图2 DNA-SIP与生物信息学分析联用的流程示意图。(图片来自网络)
   
   
2. 宏基因组分箱原理
   宏基因组分箱（Binning）基于宏基因组原始测序序列，可进一步将其中混合了不同微生物的序列或序列组装得到的contigs按物种进行分类（图3）。提取个体基因组草图(bins)可以实现宏基因组的单菌基因组水平分析。以往传统的单物种全基因组序列都是对目标菌群经过纯培养后，方能进行全基因组de novo测序。但是环境中存在着大量的不可培养微生物，Binning技术不依赖培养条件就可获得微生物的全基因组序列，从而获得新物种的基因组序列和代谢功能等生物信息。
   
   
   图3 宏基因组分箱原理示意图。（Kang et al.,2015）
   

材料与试剂

1. 普通¹²C乙酸 (北京百灵威科技有限公司，Lot: LE10Q200)
2. ¹³C乙酸 (Cambridge Isotope Laboratories,Inc，Lot: PR-29445)
3. DNA提取试剂盒(QIAGEN GmbH，Lot: 163046382)
4. qPCR试剂盒 (Takara，Lot: AJ91708A)
5. 氯化铵 (广州化学试剂厂)
6. 十二水合·磷酸氢二钠 (麦克林，Lot: C11160473)
7. 磷酸二氢钾 (广州化学试剂厂)
8. 氯化镁 (广东光华科技有限公司，Lot: 20190404)
9. 刃天青 (北京百灵威科技有限公司)
10. TE buffer (ZOMANBIO，Lot: 9BB08S)
11. 氯化铯 (BIOBOMEI，Lot: B23V1019)
12. 无水乙醇 (阿拉丁)
13. 核酸助沉剂 (ZOMANBIO)
    

仪器设备

1. 掌上离心机 (Scilogex)
2. 专用离心管 (Eppendorf Centrifuge 5430 R)
3. 超高速离心机 (Beckman Optima MAX-TL)
4. Qubit定量 (Thermo Fisher Scientific)
5. qPCR仪 (BIO-RAD CFX96 Real-Time System)
6. DNA裂解仪 (MP Biomedicals FASTPREP-24)
7. SIP分层泵 (Beckman)
8. 真空浓缩仪 (Eppendorf)
9. 振荡器 (Silentshake)
10. 折光率仪 (Atago)
    

软件和数据库

1. QIIME2 (扩增子分析主流软件)
   系列教程：https://docs.qiime2.org/2020.11/
2. Megahit宏基因组组装软件
   安装：conda install -y megahit
   使用：time megahit -t 30 \
   -1 `ls 质控后序列路径/File_1.fq|tr '\n' ','|sed 's/,$//'` \
   -2 `ls 质控后序列路径/File _2.fq|tr '\n' ','|sed 's/,$//'` \
   -o YOUR PATH/megahit --k-min 21 --k-max 121 --k-step 10
   官方文档：《MEGAHIT: an μltra-fast single-node solution for large and complex metagenomics assembly via succinct de Bruijn graph》Bioinformatics, 2015.
3. MetaWRAP宏基因组分箱软件
   安装：conda install -c ursky metawrap -mg
   使用：metawrap binning -o resμlts/01_binning -t 30 -a YOUR PATH TO/final.contigs.fa \
   --metabat2 --maxbin2 --concoct YOUR PATH TO指控后序列/File_clean_*.fastq
   官方文档：《MetaWRAP—a flexible pipeline for genome-resolved metagenomic data analysis》Microbiome, 2018.
4. Kneaddata质控软件
   安装：conda install -y kneaddata
   使用：time kneaddata -i seq/sample_1.raw.fq.gz -i seq/ sample _2.raw.fq.gz \
   -o temp/qc -v -t 30 --remove-intermediate-output \
   --trimmomatic ~/miniconda2/envs/metagenome_env/share/trimmomatic/
   --trimmomatic-options 'SLIDINGWINDOW:4:20 MINLEN:70' \
   --bowtie2-options "--very-sensitive --dovetail" -db YOUR PATH TO/db/bowtie2'
5. Prokka 细菌基因组注释
   安装：conda install -y prokka
   使用：time prokka YOUR PATH TO/megahit/final.contigs.fa --outdir temp/prokka \
   --prefix mg --metagenome --kingdom Archaea,Bacteria,Mitochondria,Viruses \
   --force --cpus 30
   官方文档：《Prokka: rapid prokaryotic genome annotation》Bioinformatics, 2015.
6. Salmon基因定量工具
   安装：conda install -y salmon
   使用：time parallel -j 3 \
   'salmon quant -i temp/salmon/index -l A -p 40 --meta \
   -1 YOUR PATH TO指控后序列/File_clean_1.fastq \
   -2 YOUR PATH TO指控后序列/File_clean_2.fastq \
   -o temp/salmon/Sample_output.quant'
   官方文档：《Salmon: fast and bias-aware quantification of transcript expression using dual-phase inference》Nature Methods, 2017.
   

说明

1. 本文以最简单的乙酸降解功能菌分析流程进行介绍，读者可根据实际需要将标记物由¹³C乙酸替换成其他标记物，如¹³C乳酸、¹³C碳酸氢钠、¹³C甲苯等。
2. ¹³C标记物建议直接购买商用产品。
3. 本文描述的¹²C标记物即为普通试剂。
4. 以下实验操作中所用的枪头、离心管、西林瓶等耗材均需经过高压灭菌处理。
   

实验步骤

一、建立共培养微宇宙 (以乙酸降解菌群为例)

1. 共培养实验设计分组如表1所示：
   
   表1.实验分组设计
   
   
   
2. 配制1 L矿物盐溶液 (MSM，配方见表2)，利用高压灭菌锅将MSM、曝气所需针头、西林瓶、胶塞灭菌，然后冷却备用；MSM当天配当天使用；
3. 称量2 g 土壤于已灭菌的西林瓶中，再加入100 ml 的MSM和100 μl的1 g/L的刃天青使用液；
4. 用氮气曝气脱氧30 min后用胶塞塞紧，再用匹配的铝盖胶塞密封；
5. 根据不同分组，利用注射器分别添加¹³C-乙酸或¹²C-乙酸至西林瓶内，充分摇匀；
6. 微宇宙放入恒温摇床，在30 °C下进行共培养，用于标记乙酸降解菌群；
7. 参与乙酸降解的菌群，可将¹³C合并至自身DNA，从而完成标记。
   
   

二、提取DNA

1. 待反应结束后，破开微宇宙，静置沉淀一段时间后倒掉部分上清液，将剩余泥水混合物小心转移至50 ml离心管后离心15min (7,500 × g)；
2. 倒掉上清液，仅保留湿土用于DNA的提取；
3. 建议使用DNA提取试剂盒提取样品的基因组DNA；
4. 利用Qubit测定所提取的DNA浓度。
   
   

三、超速离心分层

1. 经¹³C标记后的DNA密度相对于未标记的DNA更大，可由超速离心机进行分离；
2. 用TE buffer和氯化铯粉末制备CsCl预配液 (折光率RI = 1.4032)和CsCl平衡溶液 (RI = 1.4020 ± 0.0001)；
   注：每个样品需要大约5 ml的CsCl预配液，根据所需样品配制足量的溶液，如离心6个样品，制备40 ml即可；CsCl平衡溶液所需体积较少，制备5 ml左右即可。
3. 添加CsCl预配液至SIP专用离心管刻线处（图4）；
   
   
   图4. CsCl预配液添加量示意图
   
   
4. 根据提取的DNA浓度，取总量3,000 ng的DNA至SIP专用离心管中；
5. 离心管简单密封后涡旋震荡20 s，混匀CsCl预配液与DNA样品；
6. 混匀后轻轻转动离心管，严格消除管内气泡；
7. 测定混合液的RI，调节RI至1.4020 ± 0.0001。弱RI较低时可添加CsCl预配液增浓，较高时添加TE buffer稀释；
8. 注入CsCl平衡溶液至瓶口位置，完成封液（图5）；
   
   
   图5. CsCl平衡溶液的封液示意图
   
   
9. 将SIP离心管两两配平 (两管间误差需小于0.0010 g)，将离心管口热封后，对称放入转子中；配平时往较轻的离心管中添加CsCl平衡溶液，不可从管中取出，避免DNA样品的损失；
10. 超速离心条件：57,000 × g，48 h，20 °C；离心不足将导致DNA分层效果不佳；
11. 离心完成后尽快取出，平稳取出转子，进行一下步分层收集。
    
    

四、分层接管

1. 每一管超速离心样品预计分为24层；将提前灭菌的离心管写上对应编号;
2. 打开分层取样泵，每管超离样品分24层，每层取样20 s，设定流速为595 μl/min；
   注：实验前可提前进行预实验，观察取样情况，调整合适的流速。
3. 小心剪去离心管瓶颈，注意瓶口要剪平；装入收集台并压紧，上提针头，扎破瓶底；
   注：使用前可利用清水测试管路气密性，确保气密性良好再上样。
4. 开启取样泵，借用计时器手动接管，观察出液管路，以管路中连续液柱的第一滴液体滴出开始计算，每20 s手动移动至下一分层管，最后一滴可快速靠壁防止洒漏；
5. 依次收集各个样品的1-24层DNA (fraction, F1-F24, 由重至轻)；
6. 不同超离管样品采集的间隙需使用无菌水清洗管路，防止相互污染；
7. 测定各层样品的折光率RI值，并将RI值转换成浮力密度 (Buoyant Density；BD)。
   注：若分层效果较好，各层RI应呈现等差递减的趋势。
   BD值=RI *10.8601-13.4974。
8. 各层样品收集与RI测定示意图，建议以RI=1.4002为界，选取上下10层进行下游分析（图6）。
   
   
   图6. 各层样品收集示意图
   
   

五、纯化回收DNA

1. 配制纯化溶液 (配方见表3)，根据接管所得样品数量配制总纯化溶液；
   注：可以多预算5个样品量的体积，防止分加纯化溶液过程中损失。
2. 往各层收集样品中加入1,106 μl纯化溶液，置于4 °C冰箱过夜反应 (帮助核酸沉淀)；
   注：由于每管的第1、2层和第23、24层误差较大故可不进行纯化回收，仅回收剩余20层。
3. 各分层管子离心30 min (11,000 × g，4 °C)，离心完后缓慢倾斜离心管小心倒掉管中液体；
4. 将离心管放入真空浓缩仪内进行干燥 (D-AL模式，45 °C，20 min)；直至离心管内已无肉眼可见水珠；
5. 干燥完毕后，加30 μl ddH₂O或TE buffer，震荡混匀，用掌上离心机离心5 s，放入-20 °C冰箱内长期保存；
   注：若短时间内马上进行下游分子生物学分析可先放在4 °C冰箱中保存。
6. 纯化后再次测定各层样品的浮力密度BD值。
   
   

六、荧光定量qPCR分析

1. 利用qPCR方法对各层DNA量进行定量测定，以判断标记、分层效果；
2. 选取纯化回收之前所得的浮力密度BD值在1.69 - 1.78之间的分层DNA进行测试；
3. qPCR检测的目标基因可以是16S rRNA (乙酸为例)，或其他功能基因；
4. 将qPCR所需试剂和选取的DNA样品提前放入4 °C冰箱解冻、离心摇匀；
5. 按照qPCR kit说明书配置20 μl 反应溶液；
6. qPCR模板包括各层样品、标注曲线、阴性对照，且均需三个实验平行；
   qPCR反应程序根据目标基因进行设定，本文使用16S rRNA检测程序如下：
   Step1：95 °C，15min (预变性)
   Step2：94 °C，15 s；55 °C，30s ；72 °C，30 s；44个循环 (扩增)
   Step3：72 °C 7 min
   Step4：起始温度94 °C，终止温度94 °C，温度变化速率为0.5 °C (溶解曲线)
   Step5：读板
   记录qPCR结果，换算得到各层DNA样品的基因浓度，绘制渐变曲线。
   
   

七、16S rRNA测序与生物信息学分析

1. 参考qPCR结果，若¹³C-乙酸¹²C-乙酸两组样品错峰明显，表明标记效果较好，可继续对各层DNA样品进行扩增子测序；
2. 为减少测序成本，可根据qPCR结果选取各峰尖、及左右各一层，共3个样品测序。
3. 使用Earth Microbiome Project推荐的引物对基因组DNA的16S rRNA片段进行高通量测序 (Illumina MiSeq PE250)；主要分析细菌群落组成；
4. 下机数据主要使用QIIME2分析，包括序列除杂、过滤、拼接、去噪、注释等主要过程；
5. 根据物种丰度统计表，绘制各样品不同分层下的物种变化图。
   
   

八、宏基因组测序与生物信息学分析

1. 经过¹³C标记的重层DNA大大简化了乙酸降解功能菌群的生物信息，从而减少冗余数据的干扰，极大地降低了生物信息分析难度；
2. 重点针对重层DNA进行宏基因组测序 (Illumina HiSeq PE250)，测序数据量建议不低于6 G/样品；
3. 下机数据主要使用Kneaddata进行质控、除杂、过滤；
4. 利用Megahit软件对优化序列进行拼接；
5. 使用MetaWRAP进行分箱 (包括metaBAT2、CONCOCT、MaxBin2三种主流方法)，将短序列逐一组装成单菌基因组草图 (Bins)，建议拼装完整度 > 70 %，污染率 < 10 %；
6. 使用CheckM评估组装得到的Bins的质量，如基因组大小、完整性、杂合度等主要参数；
7. 使用Salmon对各个Bins进行基因定量；
8. 使用Prokka软件预测目标Bins的基因结构；
9. 利用Diamond软件作KEGG/ COG/eggNOG基因功能注释，分别获得KO和EC号后，进一步对功能基因作富集分析和通路分析；
10. 重点关注与乙酸降解密切相关的功能基因或代谢途径。
    

结果与分析

一、共培养标记后的qPCR检测结果


图7. 定量qPCR用于指示 DNA-SIP标记效率的示意图

图7所示：实验开始阶段 (第0天)，乙酸降解功能菌的基因组DNA尚未得到¹³C标记，故实验组与对照组的各层中基因拷贝数浓度较为一致。随着标记时长逐渐增加 (第10天)，乙酸降解功能菌的基因组DNA被¹³C标记，从而“变重”，故其各层中的基因拷贝数将向浮力密度更大的“重层”迁移，表现为与¹²C-乙酸对照组明显错峰，即为标记成功。
二、16S rRNA扩增子测序结果


图8. 标记样品的选择与高通量测序

图8所示：重点选取每个离心样品的各峰尖层 (F10)、及左右两层 (F9+F11) 进行测序可减少测序成本。经过物种丰度统计后，对比发现细菌A在¹³C实验组中富集，而在¹²C对照组中丰度较低，说明细菌A是潜在的乙酸降解菌群。而细菌B和细菌C在两组中的丰度差异不大，不是潜在的乙酸降解菌群。说明：本文仅设置了一个对照组进行简要说明，读者可根据实际情况设置更多对照组，排除假阳性标记结果。
三、宏基因组分箱结果


图9. 宏基因组Bins的物种注释与功能基因注释结果

图9所示：重点针对“重层”DNA样品进行宏基因组测序，并采用MetaWRAP分箱组装后一共获得了5个高质量的基因组草图 (Bins)。基于KEGG、COG等功能基因注释后，发现这些Bins含有特定的功能基因，可用于解释潜在的代谢机制。其中Bin1、2、3可注释至细菌A，与16S扩增子结果较为吻合。同时还发现了两种新型细菌 (Bin4、5)也可能是潜在的功能细菌，可进一步构建系统发育树探究其物种分类及潜在代谢能力。

溶液配方

1. 微宇宙培养的MSM溶液配方 (以1 L计，用去离子水制备)
   
   表2. MSM溶液配方
   
   
   
2. 离心样品的纯化溶液配方
   
   表3. 纯化溶液配方
   
   

失败经验

1. 共培养实验需要通过预实验探索合适的标记时长，标记过久容易导致交叉污染(Cross Feeding)，即被标记的功能细菌残体被其他非功能菌所捕食，导致非功能菌被错误标记而出现假阳性结果。
2. 判断标记效果可利用荧光、16S rRNA-qPCR、功能基因-qPCR等方法综合判定。
   

致谢

感谢广东省科学院实施创新驱动发展能力建设专项 (2020GDASYL-20200103086)，国家自然科学基金资助项目 (42007357)，广东省基础与应用基础研究基金(2019A1515110351)，中国博士后科学基金资助项目 (2019M662825 和 2020T130127)，广州市科技计划项目资助 (202002030271 和 202002020072)，广东省科学院实施创新驱动发展能力建设专项 (2019GDASYL-0103053)，广东省“珠江人才计划”项目 (2017BT01Z176 和 2017GC010570) 对本工作的大力支持。

参考文献

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2. Neufeld, J. D., Vohra, J., Dumont, M. G., Lueders, T., Manefield, M., Friedrich, M. W. and Murrell, J. C. (2007). DNA stable-isotope probing. Nature Protocols 2: 860.
3. Quince, C., Walker, A. W., Simpson, J. T., Loman, N. J. and Segata, N. (2017). Shotgun metagenomics, from sampling to analysis. Nature Biotechnology 35(9): 833.
4. Sun, W., Xiao, E., Häggblom, M., Krumins, V., Dong, Y., Sun, X., Li, F., Wang, Q., Li, B. and Yan, B. (2018). Bacterial survival strategies in an alkaline tailing site and the physiological mechanisms of dominant phylotypes as revealed by metagenomic analyses. Environmental Science & Technology 52(22): 13370-13380.
5. Zhang, M., Li, Z., Haggblom, M. M., Young, L. Y., He, Z., Li, F., Xu, R., Sun, X. and Sun, W. (2020). Characterization of nitrate-dependent As(III)-oxidizing communities in arsenic-contaminated soil and investigation of their metabolic potentials by the combination of DNA-SIP and metagenomics. Environmental Science & Technology.
6. Kang, D.D., Froμla, J., Egan, R., Wang, Z. (2015) MetaBAT, an efficient tool for accurately reconstructing single genomes from complex microbial communities. PeerJ Aug 27;3:e1165.