Analysis of Fungal Community in Mangrove Sediments Based on PacBio SMRT Sequencing   

材料与试剂

1. DNeasy PowerSoil Kit (Qiagen, catalog number: 12888-50/12888-100) 或 FastDNA Spin Kit for soil (MP Biomedicals, catalog number: 116560)
2. PrimeSTAR GXL DNA Polymerase (Takara, catalog number: R050) 或 Phusion High-Fidelity DNA Polymerase (Thermo Scientific, catalog number: F537L)
3. 无菌超纯水
   

仪器设备

1. 沉积物采样器
2. 涡旋振荡器 (带适配器) /组织研磨仪 (MP Biomedicals, MP Fastprep-24 5G)
3. NanoDrop ND-2000c UV-Vis spectrophotometer (NanoDrop Technologies)
4. ProFlex™ PCR仪 (ThermoFisher)
   

软件和数据库

一、软件

1. pbccs (v4.02, https://github.com/PacificBiosciences/ccs)
2. BAM2fastx (https://github.com/pacificbiosciences/bam2fastx/)
3. lima (v1.11.0, https://github.com/pacificbiosciences/barcoding/)
4. flexbar (v3.0, https://github.com/seqan/flexbar)
5. mothur (v1.44.2, https://github.com/mothur/mothur/releases/tag/v1.44.2)
6. vsearch (v2.15.0, https://github.com/torognes/vsearch/releases/)
7. ITSx (v1.0.11, https://microbiology.se/software/itsx/)
8. usearch (v10.0.240, https://drive5.com/usearch/)
9. BLAST+ (v2.10.1, https://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/blast/executables/blast+/LATEST/)
10. RAxML (v8.2.12, https://github.com/stamatak/standard-RAxML)
11. IQTree (v2.1.1, http://www.iqtree.org)
12. FastTree (v2.1.11, http://www.microbesonline.org/fasttree/)
    
    

二、数据库

1. UNITE (v8.2, https://doi.org/10.15156/BIO/786372) for ITS
2. Silva (release 138, https://www.arb-silva.de/documentation/) for 16S/18S rDNA
3. UCHIME reference dataset (v7.2, https://unite.ut.ee/repository.php)

实验步骤

一、样品采集与处理

1. 样品采集
           根据实验目的设计合理的实验方案，选择要采集的红树林，确定采样位置。红树林样品的采集使用特制的沉积物样品采样器，沉积物样品的采集使用三点或五点取样法。对每个样点的3-5个重复样品进行等量混合以减少采样偏差。根据实验需要可对样品按深度分层，使用无菌自封袋保存。样品需使用冰袋或干冰冷藏运输，实验室内存放于-40/-80 °C冰箱。
2. DNA提取
           参考所使用试剂盒说明书进行。若使用DNeasy PowerSoil Kit，可在机械破碎后增加60 °C水浴30 min，可提高DNA产量。使用NanoDrop确定DNA质量和浓度，并使用1%琼脂糖凝胶电泳检测。质量不好的DNA应重提或使用DNA纯化试剂盒进行纯化。
   
   

二、PCR扩增与PacBio SMRT测序

1. Primers选择
           选择合适的Primer是研究微生物群落的最重要步骤。对于真菌群落的研究通常选用ITS区域。对于ITS全长的扩增，建议优先选用对真菌群落具有极高覆盖度的引物ITS9Munngs/ITS4ngs (Tedersoo and Lindahl, 2016; Nilsson, et al., 2019) 。若上述引物扩增效果较差，可根据情况选用ITS1Fngs/ITS4ngs (White et al., 1990; Tedersoo et al., 2015) 或ITS1F/ITS4 (White et al., 1990; Gardes and Bruns, 1993) 。根据后续测序过程中的混样方案，在正反向引物上下游添加特异barcode信息，barcode长度不小于6 bp，以保证测序后数据的正确拆分。
2. PCR扩增
           PCR扩增中嵌合体的形成与循环数，聚合酶的选择和初始模板质量有很大关系，特别是长片段扩增中更容易出现嵌合体。建议选择高活性高保真度的DNA聚合酶，延长延伸时间 (Tedersoo et al., 2015) 。虽然循环数的增加容易导致嵌合体产生，但扩增效率也会随着片段长度的增加而下降，因而循环数的选择一定要慎重。ITS片段扩增的循环数可以设置为30-32个，不超过35个，当片段长度增加时可以适当增加循环数 (Tedersoo et al., 2015; Nilsson et al., 2019)。PCR扩增前将DNA模板稀释到5-10 ng/μl，以保证扩增过程中模板的一致性。由于三代测序所需DNA量较大，PCR扩增体系可选择30 μl，其中包含1.5 U polymerase，3 μl buffer，150 μM dNTPs，正反向引物各0.12 μM，2-10 ng DNA模板。PCR扩增程序为，94 °C 5 min, 94 °C 30 s, 57 °C 30 s, 72 °C 1 min 20 s, 72 °C 10 min，其中2-4步为32循环。PCR产物使用NanoDrop和1%琼脂糖凝胶电泳检测。每个样品至少设置3个重复，并将其等量混合，在以减少PCR偏差。同时每批次PCR都应设置空白对照。
3. PacBio SMRT测序
           此步骤主要由测序公司完成，简单步骤如下：将加有barcode的PCR产物按照预先设计的混样方案等量混合，然后将发卡测序接头连接到PCR文库并完成环化。使用Enzyme Clean Up Kit对测序文库进行纯化。将测序引物退火结合至PCR产物文库，并将DNA 聚合酶结合测序模板。测序使用PacBio Sequal平台进行。
   
   

三、数据分析

1. CCS (circular consensus sequencing) reads
           PacBio SMRT 通过对环化连接的插入测序片段循环进行多次测序后比对校正纠错，获得高精度的保守序列 (CCS reads) 。当循环测序数达到5次时，CCS reads的质量理论上可以达到QC40，也就是错误率0.01%。PacBio平台产生数据格式为.bam，使用pbccs软件进行环化校正得到CCS reads，命令为ccs cell01.subreads.bam cell01.ccsreads.bam --minPasses 5 --reportFile ccs_report.txt。原始文件为cell01.subreads.bam，输出文件为cell01.ccsreads.bam，--minPasses为循环数，--reportFile为统计结果文件。
2. 数据拆分 (demultiplex)
           准备barcode文件 (Barcodes.fasta) ，根据barcode信息，使用lima软件进行样品拆分：lima --ccs cell01.ccsreads.bam Barcodes.fasta split.bam --same --split-bam --split-bam-named -j 100。其中split.bam文件为输出文件，输出文件将以split.xxx.bam命名，--same表示双端引物相同，--split-bam表示按照barcode pairs拆分bam文件，--split-bam-named表示按照barcode名称对拆分后输出的bam文件命名，-j线程数。另外可先进行步骤3.3 bam转fastq，将cell01.ccsreads.bam文件转换为fastq文件后，根据barcode序列，使用flexbar软件 (Dodt et al., 2012) 进行拆分，命令为flexbar -b Barcodes.fasta -r cell01.ccsreads.fastq -t cell01.ccsreads -bt ANY -be 0.1，-b为barcode序列文件，-r为需要拆分的fastq文件，-t为输出文件前缀，-bt为--barcode-trim-end，ANY表示删除barcode两端序列，-be为--barcode-error-rate。
3. bam转fastq
           使用BAM2fastx软件进行。bam2fastq -o sample1 sample1.ccsreads.bam -u。-o为输出文件前缀，sample1.ccsreads.bam为输入bam文件，-u表示输出文件不压缩。
4. 质控过滤
           使用mothur (Schloss et al., 2009) 进行质控过滤，首先将fastq拆分为序列文件及其对应的质量分数文件fastq.info(fastq=sample1.fastq)，随后进行质控trim.seqs(fasta=sample1.fasta,minlength=100,maxambig=0,maxhomop=12,qfile=sample1.qual,qwindowsize=50,qwindowaverage=20)。
5. 文件及序列重命名
           批量修改文件名以后使用usearch (Edgar, 2010) 对序列按照文件名进行重命名，usearch11 -fastx_relabel sample1.fasta -prefix sample1- -fastaout sample1_relabel.fasta -keep_annots。-prefix为重命名序列前缀，-fastaout为输出文件名。
6. 提取ITS序列
           使用ITSx (Bengtsson-Palme et al., 2013) 进行提取。命令为ITSx -i sample1_relabel.fasta -o sample1_out --cpu 4 --save_regions all --preserve T -E 1e-2。-i输入文件名，-o输出文件名，--cpu核心数，--save_region要保留的片段，all表示保留所有片段，包括18S，28S，ITS全长，ITS1，5.8S和ITS2，--preserve序列名为原始序列名，-E，e-value。此步骤产生的sample1_out.full.fasta文件为ITS全长序列，用于后续分析。
7. 嵌合体检测与删除
           使用vsearch (Rognes et al.,2016) 进行重头嵌合体检测uchime_denovo (Edgar et al., 2011) 和基于数据库的嵌合体检测uchime_ref。uchime_denovo命令：vsearch --uchime_denovo sample1_out.full.fasta --chimeras sample1_out.full_chimeras.fasta --nonchimeras sample1_out.full_nonchimeras.fasta --relabel_keep；uchime_ref命令：vsearch --uchime_ref sample1_out.full_nonchimeras.fasta --chimeras sample1_out.ful_chimeras2.fasta --nonchimeras sample1_out.full_nonchimeras2.fasta --db uchime_reference_dataset_28.06.2017.fasta --relabel_keep --threads 25。重命名文件sample1_out.full_nonchimeras2.fasta为sample1.fasta用于后续分析。
8. 长度筛选
           绝大部分真菌ITS片段的长度为300-900 bp，极少数担子菌可达到1,100 bp (Schoch et al., 2014; Nilsson et al., 2019) 。为避免过长或过短序列干扰，使用vsearch进行片段长度筛选。vsearch --fastx_filter sample1.fasta --fastaout sample1.remian.fasta --fastaout_discarded sample1.discarded.fasta --fastq_maxlen 900 --fastq_minlen 300。
9. OTU生成与代表序列挑选
           主要使用usearch，但由于免费版32位usearch限制，在处理大数据量时结合vsearch共同使用。此步骤可以分为以下步骤：
   
   9.1

   计数与去重
           usearch -fastx_uniques sample1.remian.fasta -fastaout uniques.sample1.fasta -sizeout
   9.2

   去除单条序列
           usearch -sortbysize uniques.sample1.fasta -fastaout desingl.uniques.sample1.fasta -minsize 2。-minsize表示保留序列的最小条数。
   注：以上两步可以在vsearch中合并为一步，vsearch --derep_fulllength sample1.fasta --sizein --fasta_width 0 --sizeout --output desingl.unique.sample1.fasta --minuniquesize 2 --threads 8。
   9.3

   OTU聚类
           usearch10 -cluster_otus desingl.uniques.sample1.fasta -otus sample1.otu.fasta -uparseout sample1.otu.txt -relabel OTU -minsize 2。-otus sample1.otu.fasta输出即为OTU代表序列，usearch10默认选择丰度最高的序列为代表序列。usearch10默认使用UPARSE算法 (Edgar, 2013) 进行OTU聚类，序列相似度阈值为97%，不能更改。若想更改相似度阈值，可选择usearch10以前的早期版本，通过-id 0.97参数进行修改。常用的OTU聚类方法还有CD-HIT等方法 (Fu et al., 2012) ，此处不再赘述。
   9.4

   OTU table生成
           vsearch --usearch_global sample1.fasta --db sample1.otu.fasta --id 0.97 --otutabout sample1.otutable.txt --threads 50。以步骤3.9.3产生的OTU代表序列为数据库 (-db) 对样品数据以97%相似度 (-id) 为阈值进行聚类生成OTU table。
10. 代表序列注释
            使用软件为BLAST+，真菌ITS使用UNITE数据库。有研究表明早期的UNITE数据库中有许多序列都是错误鉴定的，将一些非真菌生物鉴定为真菌，主要为Rozellomycota和一些未知真菌。最新版的UNITE数据库分为真菌和真核两种，真菌数据库主要为真菌序列，真核数据库主要为真核序列，真核数据库相比于真菌数据库更加全面准确，因而建议使用真核数据库。构建数据库：makeblastdb -in UNITE_eukaryotes_all_04.02.2020.fasta -dbtype nucl -out unite_eukaryotes。-dbtype nucl表示数据库类型为核酸序列。注释：blastn -max_target_seqs 10 -db unite_eukaryotes -out otu.rep.seq.euk.blast -query sample1.otu.fasta -num_threads 10 -outfmt "6 qseqid qlen qstart qend salltitles sseqid slen sstart send qcovs bitscore evalue pident"。-max_target_seqs输出比对结果数量，-out输出比对结果文件，-query输入代表序列文件，-num_threads核心数，-outfmt输出文件格式，6表示表格格式，后面内容为比对结果信息。为使注释结果更加可靠，采用Tedersoo等人 (2015, 2018) 使用的注释策略，对于注释在真菌界中的OTU，以90%、85%、80%和75%的序列相似度分别作为属、科、目和纲的区分标准。
11. 系统发育注释 (可选)
            相比于二代测序而言，三代测序获得的更长的微生物maker基因序列可以获得更为精确的注释结果。但是由于人们目前对自然界微生物认识有限，现有数据库中许多微生物并未精确注释，如UNITE真核生物数据库中有许多序列被注释为“Eukaryota_kgd_Incertae_sedis”，同时有许多序列仅通过数十至上百bp的alignment进行了注释，结果不够准确，而且有许多未知微生物的序列并未被包括在数据库中。因而我们提出了基于blastn注释结果的“基于系统发育分析的微生物鉴定”，以更准确的对未知真菌进行注释。简单来说就是使用3.9.3中获得OTU代表序列 (或去除其它真核序列的真菌OTU代表序列) 构建系统发育树。常用构建系统发育树的方法有Neighbor Joining (NJ) ，Maximum Parsimony (MP) ，Maximum Likelihood (ML) 和Bayesian inference (BI) ，几种方法各有优势。此处推荐使用ML方法构建系统发育树，推荐软件有FastTree (号称速度最快的ML树构建软件，一般来简单观察系统发育关系，数据量特别大时使用) (Nguyen et al., 2015)，IQTree (一种精确快速的ML系统发育分析工具，bootstrap计算速度是RAxML的10-40倍，大数据量时强烈推荐) (Price et al., 2010)，和RAxML (最常用的系统发育树构建软件之一，支持多线程和向量指令运行，运行速度较快，数据量不是特别大时推荐使用) (Stamatakis, 2014)，请根据情况酌情选用。序列比对使用MUSCLE (Edgar, 2004) ：muscle -in input.ITS.fas -out aligned.input.ITS.muscle.fas；其中-in为输如fasta序列；-out为输出alignment文件。序列修剪使用trimAl (Capella-Gutierrez et al., 2009) ：trimal -in aligned.input.ITS.muscle.fas -out aligned.input.ITS.muscle.trim.phy -gt 0.1；-in为输如fasta序列；-out为输出alignment文件；-gt序列中允许出现gap的部分。IQTree构建系统发育树：iqtree -s aligned.input.ITS.muscle.trim.phy -m TESTONLY -nt 60 -bb 1000 -alrt 1000；-s为输入alignment文件；-nt为核心数，也可设为AUTO系统自动分配；-bb (ultrafast bootstrap approximation) 重复抽样次数，默认1,000，大数据建议-bb，小数据可用-b；-alrt 是否启用SH-aLRT检验，可删除；-m，model，不提供时iq-tree自动选择；-o可指定外群序列。FastTree构建系统发育树：FastTree aligned.input.ITS.muscle.trim.phy > aligned.input.ITS.muscle.trim.tree；数据量特别大时使用。RAxML构建系统发育树：raxmlHPC-PTHREADS-SSE3 -T 40 -f a -x 12345 -# 1000 -m GTRGAMMA -s ./BAE61387_aligned_sequences.fas.phy -n tre；若CPU支持也可选用raxmlHPC-PTHREADS-AVX或raxmlHPC-PTHREADS-AVX2，可以极大提高运行速度；-T 线程数；-f 选择RAxML算法，a为快速bootstrap分析；-x随机数；-# bootstrap；-m，model，DNA序列常用为GTRGAMMA；-s 输入文件名；-n 输出文件后缀。完成系统发育树构建后，根据OTU所在的系统发育分枝对OTU进行相应的初步注释。
    
    

四、数据统计与分析

        基于步骤三所获得的代表性序列和OTU table对真菌群落的α多样性、β多样性、生物地理学特征、分布与群落结构的影响因素，群落结构的组装过程、共现性关系等内容进行分析与可视化展示，此部分内容繁多，本文中不再赘述。

致谢

        本工作由科技部基础资源调查专项 (2019FY100700) 、国家自然科学基金 (91851105、31970105) 及中国博士后科学基金 (2020M672779) 资助。本文分析方法已应用于待发表文章“High diversity of basal fungal lineages and stochastic processes controlled fungal community assembly in mangrove sediments”。

参考文献

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