摘要:稳定同位素探针技术 (Stable isotope probing, SIP) 是一种不依赖微生物分离培养,借助稳定同位素标记化合物研究复杂原位环境中参与特定生理生化过程微生物的技术。通过向环境样品中投加稳定同位素标记的底物,待利用标记底物的微生物同化合成含有标记元素的生物标志物 (如DNA、RNA和磷酸脂肪酸等) 后,通过对比分析生物标志物鉴别降解利用该底物的微生物。RNA-SIP以RNA作为生物标志物,相较于DNA-SIP具有灵敏度高、标记速度快等优势。RNA-SIP与高通量测序结合,可深入揭示功能微生物多样性与代谢过程的分子机制。
关键词: RNA-SIP, 原位群落多样性, 群落功能, 稳定同位素标记, 等密度梯度离心
材料与试剂
仪器设备
实验步骤
稳定同位素标记底物培养实验需注意如下几点 (Lueders, 2015; Whiteley et al., 2007):1) 务必设置轻同位素对照组 (如12C和14N等),其他实验条件与标记实验组 (如13C和15N等)相同,以在结果分析中去除高GC含量RNA微生物及RNA扩散等因素导致的假阳性结果;2) 采用标记程度高的底物 (理想情况下,原子百分比 > 99%);3) 应通过预实验确定底物添加量和培养时间等,以保证足够高的RNA标记程度 (例如,13C > 15%),但也需注意,过量添加标记底物会导致培养条件偏离自然条件,而过长的培养时间会增大交叉喂养导致假阳性结果的概率。 根据环境样品类型选择适当的RNA提取方法,获得的RNA需经过琼脂糖凝胶电泳质控及核糖体RNA基因扩增 (获得阴性结果) 以确保DNA已去除,Nanodrop检测浓度和纯度,再进行精确定量 (见步骤1)。RNA短期 (不超过一个月) 可保存于-20 °C,或长期保存于-80 °C。
结果与分析
判断本实验是否成功应主要考虑如下两点:
图2. 标记实验组和对照组各区带qRT-PCR分析结果示例 A. 实验组“重”区带有较多RNA富集的环境样品 (Bradford et al., 2018); B. 实验组“重”区带无明显RNA 富集的环境样品,但仍可进一步通过测序分析探究是否有特定标记微生物种群的富集 (数据来自Zhang et al., 2017)
溶液配方
梯度缓冲液:0.1 M Tris-HCl (pH 8)、0.1 M KCl及1 mM EDTA;试剂及水须无核酸酶,配制后用0.2 μm滤膜或滤头过滤至已经过180 °C烘烤4 h的玻璃瓶中,再进行高压灭菌;灭菌后可常温保存。
致谢
本实验得到浙江省自然科学基金资助 (项目编号:LQ20C030002) 和科学技术部国家重点研发计划资助 (项目编号:2018YFE0110500)。感谢西湖大学环境微生物组与生物技术实验室 (EMBLab) 全体成员的帮助。感谢德国拜罗伊特大学微生物生态学系Tillmann Lueders教授及实验室全体成员的建议和帮助。感谢审稿人提出的修改意见,完善了实验步骤及相应的描述。
参考文献
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