Isolation and Cultivation of Lignocellulolytic Bacteria from Termite Gut    

研究背景：

木质纤维素是植物细胞壁的主要成分，是地球上最丰富的可再生生物质。天然的木质纤维素材料由纤维素、半纤维素和木质素组成 (Himmel, 2007)。白蚁以木质纤维素为食，是热带和亚热带地区木质纤维素的重要分解者 (Yamada, 2005; Kudo, 2009)。白蚁依赖自身内源性木质纤维素酶和外源性木质纤维素酶共同分解食入的木质材料，其中内源性木质纤维素酶主要由白蚁唾液腺和前肠/中肠上皮细胞分泌，外源性木质纤维素酶由共生微生物产生 (Ni and Tokuda, 2013)。白蚁后肠含有300多种共生微生物，包括原生动物、细菌、古菌等 (Hongoh, 2011)，这些共生微生物在白蚁的营养代谢、木质纤维素降解过程中发挥着重要作用 (Brune, 2014)。分离培养相关微生物有助于进一步研究木质纤维素分解菌的代谢、生理和功能酶系统。本文介绍从两种白蚁肠道分别获取纤维素和木聚糖降解细菌的方法。

材料与试剂

1. 枪头
2. 1.5 ml离心管
3. 灭菌牙签
4. 涂布棒
5. Millex-GP针头式过滤器 (Millipore)
6. 黄胸散白蚁 (采自于浙江大学华家池小区，将采集的白蚁蚁巢放置于有盖的塑料盒子中带回实验室，1周喷水1次，室内室温饲养)
7. 黄翅大白蚁 (采自于湖南衡阳地区，放置于恒温恒湿培养箱 (温度26 °C，湿度90%))
8. 琼脂 (生工生物工程有限公司，catalog number: A505255)
9. 酵母粉 (Oxoid, England, catalog number: LP0021)
10. 胰蛋白胨 (生工生物工程有限公司，catalog number: A505247)
11. NaCl, K₂HPO₄, MgSO₄, KNO₃, NaAc (国药集团化学试剂有限公司，上海，分析纯)
12. 乙醇 (国药集团化学试剂有限公司，上海，分析纯)
13. 桦木木聚糖 (Birchwood xylan) (Sigma 公司)
14. 羧甲基纤维素钠 (Carboxymethylcellulose sodium, CMC-Na) (生工生物工程有限公司)
15. 70%酒精
16. 0.9%生理盐水
17. 1 M NaCl
18. 无菌水
19. 0.1%刚果红溶液
20. 富集培养基CMC2 (见溶液配方)
21. CMC2选择平板 (见溶液配方)
22. BM基本盐培养基 (Basic Media, BM) (见溶液配方)
23. BB-培养基：在去除NaAc的BM培养基中加入0.2%的桦木木聚糖
    

仪器设备

1. 移液器
2. 玻璃试管
3. 镊子
4. 解剖针
5. 有盖的4.4 L塑料箱 (29.5 cm*20 cm*9.6 cm)
6. 体视显微镜 (奥林巴斯, 日本，model: SZ51)
7. 超净工作台 (苏净安泰，苏州，model: SW-CJ-1FD)
8. 分析天平 (赛多利斯公司，北京，model: ALC-110.4&1100.2)
9. 立式高压灭菌器 (申安公司，上海，model: LDZM-80L)
10. 电热恒温培养箱 (精宏实验设备公司，上海，model: DNP-9052)
11. 水浴振荡器 (哈东联电子技术开发有限公司，哈尔滨，model: HZS-H)
    

实验步骤

一、白蚁解剖及后肠菌悬液制备

1. 选取白蚁工蚁 (黄胸散白蚁) 5头，放置冰上稍微冷冻使其活动性减弱，便于后续操作。
2. 将白蚁放入装有70%酒精的2 ml离心管中消毒2分钟，然后转入无菌水中清洗2次，每次1分钟。
3. 用70%的酒精擦拭解剖镜的载物台，然后在载物台上滴一滴0.9%生理盐水，用镊子夹一头白蚁放于其中。
4. 按住头部，在尾部用镊子轻轻的往外拉，整个肠道即被拉出，截取后肠部分置于盛有无菌水的灭菌1.5 ml离心管中，经无菌水冲洗2次后，转入含200 μl富集培养基CMC2的1.5 ml离心管中，用无菌的解剖针搅动后肠使其内容物溢出。
5. 将上述含有5头白蚁后肠内容物的培养基转入10 ml富集培养基CMC2中混匀，即为白蚁后肠菌悬液。

二、纤维素降解菌的富集培养

1. 取上述黄胸散白蚁后肠菌悬液5 ml转入无菌的玻璃试管中，于30 °C，200 r/min条件下振荡培养。
2. 培养1~3 d后，按2%的接种量，取0.1 ml菌液转接至5 ml新的富集培养基CMC2中进行第2次富集培养。
   

三、用选择平板筛选纤维素降解菌

1. 将富集培养后的菌液做梯度稀释，涂布于CMC2选择平板(选取合适稀释倍数的菌悬液，以平板上出现均匀的单菌落为宜，本实验中稀释到10-4～10-5)。
2. 将平板放置于30 °C下恒温培养1～3 d。
3. 待长出单菌落后，用牙签点种在CMC2选择平板上。
4. 每个单菌落点种两个平板，一个平板用于刚果红染色观察，另一个作为保存平板。两个平板置于同样条件，分别于30 °C恒温培养1~3 d。刚果红染色的具体方法为：用70%酒精将菌落洗掉，然后用0.1%刚果红浸染CMC2选择平板30 min，再用1 M NaCl水溶液脱色30 min。
5. 观察菌落周围有无透明圈产生，如有透明圈产生，则可初步判断该菌株具有纤维素降解活性。
   
   

四、纤维素降解菌的分离纯化

1. 将CMC2选择平板上有透明圈的克隆划线分离，得到的单克隆进行刚果红染色。
2. 再重复上述划线分离步骤，直至得到稳定降解纤维素的单克隆。
   

五、木聚糖降解菌的分离纯化

1. 参照前面白蚁解剖和菌悬液制备的方法，从50头黄翅大白蚁工蚁获得后肠样品。
2. 以0.5%接种量接种至BB-培养基中30 °C培养3 d，至木聚糖降解较完全。
3. 将上述培养液涂布于固体BM-平板，30 °C培养3 d。
4. 将生长的克隆用牙签点种于固体BB-平板上进行筛选。
5. 在固体BB-平板上用刚果红染色实验筛选木聚糖降解菌。
   

结果与分析

一、从黄胸散白蚁分离到纤维素降解菌株
以CMC-Na为唯一碳源的富集培养基CMC2进行肠道菌富集培养，然后涂布于CMC2选择平板上进行培养和筛选。在10-4～10-5稀释倍数下分离出单菌落，单菌落经点种、刚果红染色后，观察到透明圈。对产生透明圈的菌落重复点种2次，在30 °C培养条件下分离到10个纤维素降解菌株 (图1A) (吴燕，2011)。

二、从黄翅大白蚁后肠分离到木聚糖降解菌
目前，还没有报道白蚁甚至是昆虫来源的木聚糖酶，但是在白蚁肠道内能够检测到木聚糖酶的活性 (宁娜，2015)，其白蚁肠道内的木聚糖酶可能是由肠道共生微生物提供。使用在BM培养基基础上调整后的BB-培养基：即在BM培养基中去除NaAc，加入0.2%桦木木聚糖，通过平板筛选和刚果红染色实验获得一株木聚糖降解菌Mb1 (石小玉，2016)。

图1. 木质纤维素降解菌筛选和刚果红染色平板
注：A：纤维素降解菌的筛选。B: 木聚糖降解菌的划线培养。C和D：木聚糖降解菌的筛选和刚果红染色。

失败经验

选用含有酵母粉 (0.2%)，以CMC-Na为唯一碳源的培养基富集培养2次，刚果红染色法分析了约400个菌落，没有获得有透明圈克隆。在富集培养基中加入无机氮源KNO3 (0.1%) 代替酵母粉，获得有透明圈的克隆，另外在37 °C条件下培养的菌落，通过以上步骤没有分离到具有纤维素酶活的微生物。

溶液配方

1. 富集培养基CMC2：
   KH₂PO₄ 2 g，MgSO₄ 0.15 g，KNO₂ 1 g，CMC-Na 10 g，加蒸馏水定容至1 L。121 °C，高压蒸汽灭菌30 min。
2. CMC2选择平板：
   酵母粉5 g，胰蛋白胨10 g，CMC-Na 2 g，NaCl 10 g，琼脂15 g，加蒸馏水定容至1 L。121 °C，高压蒸汽灭菌30 min。
3. BM基本盐培养基 (Basic Media, BM)：
   KH₂PO₄ 0.2 g，NH₄Cl 0.25 g，KCl 0.5 g，CaCl₂·2H₂O 0.15 g，NaCl 1.0 g，NaAc 0.0246 g，MgCl₂·6H₂O 0.62 g，Na₂SO₄ 2.84 g，HEPES (pH 6.8) 10 mM；trace element solution 1 ml；mixed vitamin stock solution 1 ml；琼脂18 g，加蒸馏水定容至1 L。
4. Trace element stock solution g/L：
   FeCl₂·4H₂O 1.5 g，CoCl₂·6H₂O 0.19 g，MnCl₂·4H₂O 0.1 g，ZnCl₂ 0.07 g，H₃BO₃ 0.006 g，Na₂MoO₄·2H2O 0.036 g，NiCl₂·H₂O 0.024 g，CaCl₂.H₂O 0.002 mg，HCl (25% (v/v), 配制10 ml过滤除菌。
5. Mixed vitamin stock solution：
   4-aminobenzoic acid 0.04 g，biotin 0.01 g，nicotinic acid 0.1 g，calcium-pantothenate，0.05 g，配制10 ml，然后用Millex-GP针头式过滤器过滤除菌。
6. BB-培养基：
   BM-NaAc+ 0.2% Birchwood xylan，即在无NaAc的BM培养基中加入0.2%的桦木木聚糖 (Birchwood xylan)。
   

致谢

本项目获得国家重点基础研究发展计划 (973计划, 编号：2011CB707402)，国家自然科学基金 (编号：31970119, 31272370, 30870085)及山东大学微生物技术国家重点实验室自主设置课题的支持。

参考文献

1. 宁 娜，张倪，吴 燕, 倪金凤. (2015). 台湾乳白蚁和黄翅大白蚁消化道主要木质纤维素降解酶活性的比较. 应用与环境生物学报 21(4): 678-682.
2. 石小玉，张宁，宁娜，员超，倪金凤. (2016). 一株培菌白蚁后肠木聚糖降解细菌的分离与鉴定. 微生物学通报 43(3): 504−509.
3. 吴燕, 迟绍丽，倪金凤. (2011). 从白蚁中分离到具有纤维素酶活的贪噬菌. 应用昆虫学报 48(1): 33-28.
4. Brune, A. (2014). Symbiotic digestion of lignocellulose in termite guts. Nat Rev Microbiol 12(3): 168-180.
5. Himmel, M. E., Ding, S. Y., Johnson, D. K., Adney, W. S., Nimlos, M. R., Brady, J. W. and Foust, T. D. (2007). Biomass recalcitrance: engineering plants and enzymes for biofuels production. Science 315(5813): 804-807.
6. Hongoh, Y. (2011). Toward the functional analysis of uncultivable, symbiotic microorganisms in the termite gut. Cell Mol Life Sci 68(8): 1311-1325.
7. Kudo, T. (2009). Termite-microbe symbiotic system and its efficient degradation of lignocellulose. Biosci Biotechnol Biochem 73(12): 2561-2567
8. Ni, J. and Tokuda, G. (2013). Lignocellulose-degrading enzymes from termites and their symbiotic microbiota. Biotechnol Adv 31(6): 838-850.
9. Yamada, A., Inoue, T., Wiwatwitaya, D., Ohkuma, M., Kudo, T., Abe, T. and Sugimoto, A. (2005). Carbon mineralization by termites in tropical forests, with emphasis on fungus combs. Ecol Res 20(4): 453-460.