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Isolation and Cultivation of Actinomycetes from the Gut of Macrotermes Barneyi   

蒋宇彤蒋宇彤*未建华未建华*李净净李净净倪金凤倪金凤  (*contributed equally to this work)
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摘要:黄翅大白蚁是广泛分布于中国南部地区的一种主要培菌白蚁,为探究培菌白蚁肠道微生物的抗菌防御作用,我们对黄翅大白蚁相关放线菌展开了研究。本方案介绍从黄翅大白蚁肠道分离培养放线菌的方法。

关键词: 培菌白蚁, 黄翅大白蚁, 肠道微生物, 放线菌

研究背景

黄翅大白蚁作为一种培菌白蚁,与特定真菌-鸡枞菌 (Termitomyces) 共生,在白蚁巢内建立菌圃,培养小白球菌 (Termitosphaeria duthiei (Berk.) Ciferri.) 为白蚁提供营养 (Hager et al., 2013;Ramadhar et al., 2014)。培菌白蚁主要分布在非洲和亚洲热带地区,在植物废弃物的降解过程中发挥重要作用 (Aanen et al., 2005)。培菌白蚁自身和菌圃真菌 (鸡枞菌) 易受多种真菌侵染,但在健康的白蚁蚁巢中只有鸡枞菌生长,白蚁或其共生菌必然存在一定的机制来抵制致病菌,其中放线菌作为次级代谢产物主要产生者,可能起着关键的作用 (徐晓 ,2018)。培菌昆虫相关放线菌是天然产物的广泛来源,结构多样的次级代谢物包括多肽、大环内酯、多烯、醌酮和生物碱等,常参与到微生物-宿主的相互作用中 (未建华 ,2019)。昆虫肠道、体表及巢穴作为多种微生物的栖息地,蕴含着丰富的放线菌资源,本文主要介绍从培菌白蚁肠道分离放线菌的方法。

材料与试剂

  1. 无菌培养皿
  2. 琼脂 (生工生物工程有限公司,产品目录号: A505255)
  3. 酵母粉 (Oxoid, England, 产品目录号: LP0021)
  4. 胰蛋白胨 (生工生物工程有限公司,产品目录号: A505247)
  5. 麸皮琼脂培养基 (索莱宝,北京,产品目录号: LA8720)
  6. 无机盐 (NaCl,KCl,Na2HPO4,NaH2PO4,KNO3,K2HPO4·3H2O,MgSO4·7H2O,FeSO4·7H2O,K2HPO4,MgSO4,(NH4)2SO4,CaCO3,MnCl2·4H2O,ZnSO4·7H2O皆购自国药集团化学试剂有限公司,中国,分析纯)
  7. 引物合成,PCR产物测序 (北京六合华大基因科技股份有限公司)
  8. 16SrRNA通用引物: 27F (5’-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3’);1492R (5’-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3’)
  9. 基因组提取试剂盒 (Bacterial DNA Kit 500,Omega bio-tek公司,D3350-01)
  10. DNA纯化试剂盒 (Gel Extraction Kit 200,Omega bio-tek公司,D2500-02)
  11. PBS缓冲液 (见溶液配方)
  12. 高氏一号培养基 (见溶液配方)
  13. 可溶性淀粉培养基 (见溶液配方)
  14. 1,000×微量盐溶液 (见溶液配方)
  15. 麸皮培养基 (见溶液配方)
  16. LB 培养基 (见溶液配方)

仪器设备

  1. 超净工作台 (品牌AIRTCH)
  2. 涂布棒
  3. 分析天平 (赛多利斯公司,北京,型号: ALC-110.4&1100.2)
  4. 高压灭菌器 (爱博公司,山东)
  5. 恒温培养箱 (精宏实验设备公司,上海,型号: DNP-9052)
  6. 恒温水浴摇床 (知楚仪器公司,上海)
  7. PCR仪 (品牌TaKaRa)
  8. 电泳仪 (六一电泳器材厂公司,北京,型号: DYY-10C)
  9. 恒温金属浴 (博日科技公司,杭州)
  10. 凝胶成像仪 (品牌UVItec)
  11. 离心机 (品牌Eppendorf,型号: Centrifuge 5417)
  12. 移液器

软件和数据库

  1. 利用细菌16S序列进行菌种鉴定网站https://www.ezbiocloud.net/identify; https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/.
  2. 各国菌种保藏中心网址 (可参考各种培养基的配制方法,并且每种微生物都有其对应的培养基):
    2.1
    德国微生物菌种保藏中心 (DSMZ) Leibniz Institute DSMZ-German Collection of Microorganisms and Cell Cultures, https://www.dsmz.de/.
    2.2
    日本菌种保藏中心 (JCM) Japan Collection of Microorganisms, https://jcm.brc.riken.jp/en/.
    2.3
    韩国菌种保藏中心 (KCTC) Korean collection for type cultures, https://kctc.kribb.re.kr/En/Kctc.
  3. MAGE7.0 软件,下载地址MEGA7.0.26_win64_setup.exe, https://www.megasoftware.net/.

实验步骤

一、 白蚁肠道放线菌的分离与纯化

  1. 白蚁前、中肠样品准备参照Wu文章中的方法 (Wu et al., 2012),解剖后用研磨棒充分研磨样品5-10 min,直至肠道样品呈均质状态。
  2. 取各个梯度PBS稀释液 (10-1、10-2、10-3、10-4) 150 μl分别涂布于高氏一号培养基中,30 °C培养,每天观察平板上菌落生长情况。
  3. 根据菌落大小和形态,在平板上挑取典型的放线菌菌落 (菌落干燥紧致、明显产孢) 。
  4. 通过稀释涂布和划线的方法,经可溶性淀粉培养基纯化至只有同一种菌落,即得到纯化的克隆。

二、 白蚁肠道分离菌株的序列分析

  1. 将纯化的菌株接入20 ml液体麸皮培养基中,30 °C培养3 d后,离心收集菌体。
  2. 利用基因组试剂盒提取菌株的基因组DNA,用分光光度计和琼脂糖电泳法检测DNA浓度和纯度。
  3. 利用16S rRNA 通用引物27F 和1492R 扩增16S rRNA,PCR 体系为基因组DNA (50-200 ng/μl) 1 μl,27F 1 μl,1492R 1 μl,dNTPs 4 μl,10×Buffer 5 μl, EasyTaq 1 μl,ddH2O 37 μl。PCR 条件为预变性95 °C 5 min;95 °C 30 s,58 °C 45 s,72 °C 2 min,35个PCR循环;终延伸72 °C 10 min。
  4. 将获得的PCR产物进行琼脂糖 (1%) 凝胶电泳。
  5. 切胶回收1500 bp片段,用DNA纯化试剂盒纯化PCR片段,纯化片段送上海生工测序。
  6. 测序结果利用NCBI Blast比对,取相似性高的序列,利用MAGE7.0 软件邻位法构建系统发育树。

结果与分析

       从高氏一号培养基上挑选典型的放线菌菌落,在前肠菌悬液稀释10 倍后的平板上有比较多的具有放线菌特征的菌落。放线菌在黄翅大白蚁肠道不是优势菌,因而在较低的稀释倍数时可以得到较多的放线菌,但同一平板上细菌数目也很多,经多次稀释涂布平板和平板划线后,最后得到 13 株放线菌菌株 (表1) 。其中工蚁 (Worker) 前肠 (Foregut) 来源的有11 株,为 WF-1、WF-2、WF-3、WF-4、WF-5、WF-6、WF-7、WF-8、WF-12、WF-13、WF-14,其相似性最高的菌株分别是 Kitasatospora cheerisanensisK. cheerisanensisStreptomyces puniceusS. coelicoflavusS. tacrolimicusK. phosalacineaS. pratensisS. luridiscabieiK. purpeofuscaK.purpeofuscaS. viridobrunneus,最大相似性为 98.14%-99.93%。从工蚁中肠 (Midgut) 得到 2株放线菌:WM-1 和 WM-3,同 S. badiusS. fumigatiscleroticus 相似性分别为 99.79%和 99.38%。

表1. 基于16S rRNA 的13 株放线菌相似菌株

T: Type strain

      从 NCBI 网站分别下载 13 株相似菌株的 16S rRNA 序列,利用 MAGE 7.0 软件中的 Neighbor-joining 法制作进化树,比对方法为 ClustalW。从发育树 (图 1) 可以看出,WF-1、WF-2、WF-6、WF-12、WF-13 属于 北里孢菌属 (Kitasatospora),WF-3、WF-4、WF-5、WF-7、WF-8、WF-14、WM-1 和 WM-3 属于 链霉菌属 (Streptomyces),13 株菌都属于链霉菌科 Streptomycetaceae。菌株 WF-5 与 S. tacrolimicus 相似性最高,同源性为 98.14%,低于 98.65%,且系统发育树处于单独的分枝,推测菌株 WF-5是一株新的链霉菌。


图1. 基于16S rRNA 序列的系统发育树分析 (邻位法)

注意事项

  1. 采集到的白蚁材料尽量在新鲜状态下立即解剖,以保证肠道放线菌的分离效果。
  2. 在解剖白蚁前,清洗消毒白蚁体表,以防止体外菌的污染。
  3. 解剖过程中先将白蚁头部去掉,按住白蚁用解剖针从尾部缓缓拉出肠道,可以保持肠道的完整性。

溶液配方

  1. PBS缓冲液
    NaCl 4 g,KCl 0.1 g,Na2HPO4 0.72 g,NaH2PO4 0.12 g,加蒸馏水500 ml,pH 7.4
  2. 高氏一号培养基 (g/L)
    可溶性淀粉20 g,KNO3 1 g,K2HPO4·3H2O 0.5 g,MgSO4·7H2O 0.5 g,NaCl 0.5 g,FeSO4·7H2O 0.01 g,琼脂18 g,加蒸馏水定容至1 L
  3. 可溶性淀粉培养基 (g/L)
    可溶性淀粉10 g,K2HPO4 1 g,MgSO4 1 g,NaCl 1 g,(NH4)2SO4 2 g,CaCO3 2 g,微量盐溶液1 ml,加蒸馏水定容至1 L,pH 7.2
  4. 1,000×微量盐溶液 (g/L)
    MnCl2·4H2O 0.1 g, FeSO4·7H2O 0.1 g, ZnSO4·7H2O 0.1 g,加蒸馏水定容至1 L
  5. 麸皮培养基 (g/L)
    100 g麸皮加入适量水,沸水煮30 min,经纱布去除沉淀后,加蒸馏水定容至1 L
  6. LB 培养基 (g/L)
    NaCl 10 g,胰蛋白胨10 g,酵母提取物5 g,琼脂15 g,加蒸馏水定容至1 L,液体培养基不加琼脂粉

致谢

本项目获得国家重点基础研究发展计划 (973计划,编号:2011CB707402),国家自然科学基金 (编号:31970119, 31272370, 30870085) 及山东大学微生物技术国家重点实验室自主设置课题的支持。

参考文献

  1. 未建华,李净净和倪金凤. (2019). 培菌昆虫相关放线菌的次级代谢产物研究进展. 微生物学报 59(10): 1864-1871.
  2. 徐晓, 孙飞飞, 尹彩萍, 王滢和张应烙 (2018). 昆虫共生菌的次级代谢产物研究进展. 微生物学报 58(6): 1126-1140.
  3. Aanen, D. K. and Eggleton, P. (2005). Fungus-growing termites originated in African rain forest. Curr Biol 15(9): 851-855.
  4. Hager, F. A. and Kirchner, W. H. (2013). Vibrational long-distance communication in the termites Macrotermes natalensis and Odontotermes sp. J Exp Biol 216(Pt 17): 3249-3256.
  5. Ramadhar, T. R., Beemelmanns, C., Currie, C. R. and Clardy, J. (2014). Bacterial symbionts in agricultural systems provide a strategic source for antibiotic discovery. J Antibiot (Tokyo) 67(1): 53-58.
  6. Wu, Y., Chi, S., Yun, C., Shen, Y., Tokuda, G. and Ni, J. (2012). Molecular cloning and characterization of an endogenous digestive beta-glucosidase from the midgut of the fungus-growing termite Macrotermes barneyi. Insect Mol Biol 21(6): 604-614.
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Copyright: © 2021 The Authors; exclusive licensee Bio-protocol LLC.
引用格式:蒋宇彤, 未建华, 李净净, 倪金凤. (2021). 黄翅大白蚁肠道放线菌的分离与培养. Bio-101: e2003675. DOI: 10.21769/BioProtoc.2003675.
How to cite: Jiang, Y. T., Wei, J. H., Li, J. J. and Ni, J. F. (2021). Isolation and Cultivation of Actinomycetes from the Gut of Macrotermes Barneyi. Bio-101: e2003675. DOI: 10.21769/BioProtoc.2003675.
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