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枫香-真菌互作培养体系构建   

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摘要:林木可与真菌形成多种不同类型的关系以适应复杂的生存环境。作为林木-真菌互作研究的常见树种之一,北美枫香 (Liquidambar styraciflua) 是一种优良的抗逆树种选育材料,具有耐干旱、耐瘠薄、萌芽能力强、生长速度快等特点,通过播种繁殖易获得实生苗,经消毒处理后可得到无菌苗用于枫香-真菌互作培养体系构建。此外,北美枫香是优良的彩叶树种,叶入秋变红,是极具生态研究价值及观赏经济价值的造林绿化树种。为了探究枫香-真菌的互作机制及促进枫香适应环境胁迫的效应,需要建立标准的实验室体系互作研究方法。本文介绍了枫香-真菌互作培养体系的构建方法,包括育苗体系和接种方法等。

关键词: 枫香, 真菌, 互作体系

材料与试剂

  1. 纱布
  2.  滤纸
  3. 封口膜
  4.  泥炭土
  5.  珍珠岩
  6. 蛭石
  7. 有机肥
  8.  ddH2O
  9.  超纯水
  10.  WPM粉末 (EKEAR)
  11. 11. 改良MS培养基 (见溶液配方)
  12. 20× 大量元素母液 (见溶液配方)
  13.  100× 微量元素母液 (见溶液配方)
  14.  100× 铁盐母液 (见溶液配方)
  15.  100× 有机化合物母液 (见溶液配方)
  16.  IBA母液 (见溶液配方)
  17.  0.85%生理盐水 (见溶液配方)
  18.  0.1%升汞 (见溶液配方)
  19. PDA培养基 (见溶液配方)
  20.  WPM培养基 (见溶液配方)

仪器设备

  1.  接种针
  2. 毛刷
  3.  剪刀
  4.  镊子
  5.  漏斗
  6.  锥形瓶
  7. 移液枪
  8.  血球计数板
  9.  打孔器 (直径7 mm)
  10. 试管 (25 mm × 240 mm)
  11. 大培养皿 (直径15 cm)
  12.  光学显微镜 (Carl Zeiss, model: Axio Scope A1)
  13. 光照培养箱 (宁波扬辉,model: RDN-1500B)
  14. PhytatrayTMⅡ培养容器 (sigma, catalog number: P5929)
  15.  立式压力蒸汽灭菌器 (上海申安,model: LDZF-50KB-II)

实验步骤

  1. 真菌接种剂的准备
    1.1
    菌饼接种剂准备
    1)
    PDA培养基灭菌后取出,室温下放置,待培养基温度约45 °C后,倒入一次性塑料培养皿中,待培养基凝固后,进行接种处理。
    2)
    从纯培养真菌平板菌落边缘用接种针挑取菌块,转移至PDA固体培养基上26 °C黑暗条件下培养。
    3)
    待培养7 d后,自菌落边缘使用打孔器 (直径7 mm) 取菌饼作接种剂。

    1.2
    孢子悬浮液接种剂准备
    1)
    PDA培养基灭菌后取出,室温下放置,待培养基温度约45 °C后,倒入一次性塑料培养皿中,待培养基凝固后,进行接种处理。
    2)
    从纯培养真菌平板菌落边缘用接种针挑取菌块,转移至PDA固体培养基上26 °C黑暗条件下培养14 d。
    3)
    制备终浓度为1 × 106 ml-1的孢子悬浮液。制备方法如下:取上一步骤中培养14 d的真菌,在其表面倒一层无菌生理盐水 (0.85% NaCl溶液),用无菌毛刷轻轻刮取菌丝。以四层无菌纱布过滤并收集滤液;取滤液50 ml,沿着盖玻片边缘滴入血球计数板计数室,使用光学显微镜进行计数;用生理盐水稀释至浓度为1 × 106 ml-1的孢子悬浮液作接种剂。


  2.  无菌北美枫香幼苗的培育
    2.1
    枫香果实成熟期为10-11月份,果穗由绿色转为黄绿色,果实采集后阴干4-7 d,然后暴晒数日,用棍打果实即可获得枫香种子 (种子在0-5 °C条件下可贮存5年左右,在-18 °C时贮存时间超过5年)。将枫香种子播种育苗床。土壤基质及其配比:泥炭土:珍珠岩:蛭石:有机肥=1:2:2:2 (121 °C高压灭菌30 min),放置于光照培养箱,保持85%相对湿度,光照条件为14 h光照/10 h黑暗,25 °C恒温培养。
    2.2
    21 d后,当种子萌发并长成株高3-4 cm的幼苗时 (如图1所示),从土壤基质中取出。


    图1. 北美枫香实生幼苗培育. 图为在育苗床中播种繁殖的枫香实生幼苗,实生幼苗培养条件为:25 °C恒温;85%相对湿度;14 h光照/10 h黑暗。

    2.3
    在超净工作台剪去幼苗根部,将剩余地上部分放入0.1%升汞中进行表面消毒约12 min,再用ddH2O清洗4-5次去除表面残留升汞。
    2.4
    林木专用生根培养基——WPM培养基 (Woody Plant Medium) 灭菌后取出,室温下放置,待培养基温度约45 °C后,在超净工作台中倒入无菌试管 (25 ×240 mm) 中,待培养基凝固后,将表面消毒后的幼苗插入培养基 (如图2所示)。


    图2. 枫香幼苗生根培养示意图. 图为在装有WPM培养基的无菌试管中进行幼苗生根培养,光照培养箱内生根培养条件为25 °C恒温;14 h光照/10 h黑暗。

    2.5
    将培养有枫香实生幼苗的试管转移到光照培养箱中,25 °C恒温培养,光照条件14 h光照/10 h黑暗。待实生幼苗重新生根,苗高达到5-6 cm后,可将幼苗取出进行继代繁殖。将每一株幼苗的幼茎剪断,再次插入新的WPM培养基中进行扩繁,转移到光照培养箱中并保持同样的温度和光照条件进行继代繁殖。
    2.6
    选取根系大小、发达程度和株高较一致 (5-6 cm) 的无菌幼苗,进行共培养。

  3. 实验室体系:枫香无菌幼苗-根系真菌互作体系构建
    3.1
    菌饼接种互作体系构建
    1)
    超净工作台紫外消毒后,无菌PhytatrayTMⅡ培养容器 (长宽高:11.4 cm × 8.6 cm × 10.2 cm) 中倒入70 ml改良MS培养基。
    2)
    将步骤2挑选的根系和株高较为均一的枫香无菌幼苗用镊子将轻轻取出,放入装有ddH2O的玻璃大培养皿中,洗除幼苗根部的培养基残留,并用无菌滤纸吸干表面水份后,转接至装有改良MS培养基的PhytatrayTMⅡ无菌培养容器内。
    3)
    分为对照组和处理组,每组设置至少3个重复,每个重复包含10株无菌苗 (如图3所示)。将步骤1.1中打孔获得的菌饼随机挑取5个均匀转接至根系周围,对照组接种灭菌后的菌饼,用封口膜进行密封,防止污染。而后,转移至光照培养箱中以相同条件继续培养,根据自身实验要求设计共培养时间,然后取样进行生理指标的测定。

    3.2
    孢子悬浮液接种互作体系构建
    1)
    超净工作台紫外消毒后,无菌PhytatrayTMⅡ培养容器 (长宽高:11.4 cm × 8.6 cm × 10.2 cm) 中倒入70 ml改良MS培养基。
    2)
    将步骤2挑选的根系和株高较为均一的枫香无菌幼苗用镊子将轻轻取出,放入装有ddH2O的玻璃大培养皿中,洗除幼苗根部的培养基残留,并用无菌滤纸吸干表面水份后,转接至装有改良MS培养基的PhytatrayTMⅡ无菌培养容器内。
    3)
    分为对照组和处理组,每组设置至少3个重复,每个重复包含10株无菌苗 (如图3所示)。将步骤1.2中稀释获得的孢子悬浮液用移液枪吸取1 ml接种至根系周围,对照组加入0.85%无菌生理盐水1 ml。而后,转移至光照培养箱中以相同条件继续培养,根据自身实验要求设计共培养时间,然后取样进行生理指标的测定。


    图3. 枫香-真菌共培养体系示意图. 图为在装有改良MS培养基的PhytatrayTMⅡ无菌培养容器中进行枫香-真菌共培养实验 a:接种无菌PDA琼脂块作空白对照组;b:接种长满菌丝的菌块作实验处理组


溶液配方

  1. PDA培养基
    马铃薯 200 g (去皮煮熟后过滤取汁液)
    葡萄糖 20 g
    琼脂 15 g
    加超纯水至1 L,调pH至7.0,121 °C高温高压灭菌15 min
  2.  WPM培养基 (Woody Plant Medium)
    WPM粉末 2.78 g
    蔗糖 20 g
    琼脂粉 7 g
    IBA母液 600 μl
    加超纯水至1 L,调pH至5.8,121 °C高温高压灭菌15 min
  3.  改良MS培养基
    20× 大量元素母液 25 ml
    100× 微量元素 10 ml
    100× 铁盐母液 10 ml
    100× 有机化合物 10 ml
    蔗糖 2 g
    琼脂粉 7 g
    加超纯水至1 L,调pH至5.8 ,121 °C高温高压灭菌25 min
  4.  20× 大量元素母液
    NH4NO3 33 g
    KNO3 38 g
    CaCl2·2H2O 8.8 g
    MgSO4·7H2O 7.4 g
    KH2PO4 3.4 g
    加超纯水至1 L
  5. 100× 微量元素母液
    KI 0.083 g
    H3BO3 0.62 g
    MnSO4·4H2O 1.69 g
    ZnSO4·7H2O 0.86 g
    NaMoO4·2H2O 0.0025 g
    CuSO4·5H2O 0.0025 g
    CoCl2·6H2O 0.0025 g
    加超纯水至1 L
  6.  100× 铁盐母液
    FeSO4·7H2O 2.78 g
    Na2EDTA·2H2O 3.73 g
    加超纯水至1 L
  7.  100× 有机化合物母液
    肌醇 10 g
    IVB 烟酸 0.05 g
    盐酸硫胺素 0.01 g
    盐酸吡哚醇 0.05 g
    甘氨酸 0.2 g
    加超纯水至1 L
  8.  IBA母液
    IBA粉末 40 mg
    溶于少量无水乙醇,吹打混匀
    加60 °C超纯水至80 ml
  9. 0.1%升汞
    升汞 1 g
    溶于少量无水乙醇,吹打混匀
    加超纯水至1 L
  10.  0.85%生理盐水
    NaCl 8.5 g
    加超纯水至1 L,121 °C高温高压灭菌15 min

致谢

本工作的顺利开展得益于国家自然科学基金青年项目 (31901290) 的经费支持。

参考文献

  1. 秦媛. (2017). 盐碱地植物共生微生物资源及功能初步研究. 硕士学位论文. 中国林业科学研究院.
  2. 潘雪玉. (2018). 沿海防护林树种促生、耐盐根系真菌筛选及机制初探. 硕士学位论文. 中国林业科学研究院.
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Copyright: © 2021 The Authors; exclusive licensee Bio-protocol LLC.
引用格式:王玉宸, 彭龙, 潘雪玉, 袁志林. (2021). 枫香-真菌互作培养体系构建. Bio-101: e2003660. DOI: 10.21769/BioProtoc.2003660.
How to cite: Wang, Y. C., Peng, L., Pan, X. Y. and Yuan, Z. L. (2021). Method for Constructing Liquidambar Styraciflua, Root Fungus Interaction System. Bio-101: e2003660. DOI: 10.21769/BioProtoc.2003660.
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