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Protocol for Sampling of Root and Rhizosphere Soils from Trees in Natural Fields   

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摘要:微生物在林业生产力中发挥着越来越重要的作用,树木根系与土壤微生物交流非常密切,并且树木根系可与多种类型微生物 (根际促生菌、外生菌根真菌和丛枝菌根真菌等) 建立共生关系 (图1)。为了方便研究植物-微生物的互作机制,本文描述了野外树木根系采集和根际土收集的具体方法,即获得树木根系样品后,在缓冲液中震荡,去除根系,最后离心获得根际土。从而方便开展后续菌群组成和结构分析,以及分离纯化菌株等研究。

关键词: 树木, 根系取样, 根际土收集



 
图1. 杨树地上地下部分共生菌类型 (图片引自潘雪玉,2018)

材料与试剂

  1. 标签纸
  2. 采样记录表
  3. 冰袋或干冰
  4. 无菌采样袋
  5. 油性记号笔
  6. 50 ml离心管
  7. 一次性无菌乳胶手套
  8. NaCl (国药集团化学试剂有限公司,沪试,catalog number: 7647-14-5)
  9. Na2HPO4 (国药集团化学试剂有限公司,沪试,catalog number: 20040618)
  10. NaH2PO4 (国药集团化学试剂有限公司,沪试,catalog number: 20040818)
  11. 10 mM PBS溶液 (见溶液配方)

仪器设备

  1. 铁铲
  2. 取土钻
  3. 修枝剪
  4. GPS定位器 (南京君灿仪器设备有限公司,彩途,model: K82B)
  5. 生物样品采样箱
  6. 小锄头 (中间半椭圆豁口)
  7. 全温振荡器 (苏州培英实验设备有限公司,培英,model: THZ-C-1)
  8. 台式高速冷冻离心机 (Sigma公司,Sigma,model: 3K15)

实验步骤

一、 采样计划与前期准备

  1. 确定采样目的、区域、样点分布等。
  2. 准备器具:详见材料与试剂,仪器设备。
  3. 制定采样记录表,包括如下内容:采样点经纬度、采样日期、采样人、气候信息 (包括气温、降雨、湿度等),以及所有影响后续研究的其他环境因素。

二、 根系取样

  1. 建议选择具有代表性的土壤,一般随机选择健康的树木作为根际土取样目标。采样时建议使用五点取样法采集样品,即先确定对角线的中点作为中心取样点,而后在对角线上选择与中心点距离相等的点进行取样。或者使用等距离取样法,由取样的比率决定距离或间隔 (图2)。


    图2. 五点取样法和等距取样法示意图

  2. 采样使用的所有工具、采样袋或其他物品等,均需无菌。若野外缺乏合适的灭菌条件,可以使用采集位点临近区域的原始土壤对取样工具进行擦拭,尽量去除干扰。
  3. 用铲子去除地表植被和其他杂质,使用小锄头轻轻刨开土壤,寻找树木的细根(直径≤2 mm) (Berhongaray et al., 2013),或使用土钻获取土壤和根系的混合样,再挑出细根。细根是树木吸收养分和水分的主要器官 (Guo et al., 2008),同时也是与土壤接触最为密切的器官 (Norby and Jackson, 2000),对树木的生长发育起着关键作用。因此,研究树木细根的根际微生物对提高林木生产具有重要意义。以杨树为例,距离树干0-1 m的范围为细根集中分布区,树木根系样品的收集范围在地下5-20 cm内,因为杨树细根主要集中分布在该范围内 ( Mulia and Dupraz, 2006; Lacercat et al., 2016)。使用修枝剪剪取细根,每棵树木收集至少10 g根系样品。每个处理组至少5个生物学重复,一般推荐10个生物学重复。
  4. 将收集的根系样本分装至无菌采样袋中并做好标记,密封保存。无菌采样袋立即放入生物样品采样箱中低温保存 (采样箱内提前放入冰袋或干冰)。低温运送至实验室进行根际土的收集。

三、 实验室根际土收集

    按以下步骤收集根际土:
  1. 在超净工作台内抖落根系的bulk soils (即非根际土),附着在根部约1mm厚的土壤被定义为根际土壤 (图3) (Edwards et al., 2015)。
  2. 将根系样品转移至含20 ml无菌10 mM PBS溶液的无菌50 ml离心管中,放置于全温摇床120 rpm/min,室温下震荡20 min (Beckers et al., 2016; Beckers et al., 2017)。
  3. 使用无菌镊子 (将镊子放在酒精灯火焰上进行高温消毒,用无菌水冷却至常温后使用) 挑除50 ml离心管中的根系,剩余悬浮液高速离心 (6,000 × g,4 °C) 20 min (秦媛等,2018) 收集根际土壤 (图4)。
  4. 收集的根际土壤样品可直接进行后续实验,或液氮速冻后,置于-80 °C超低温冰箱保存。


    图3. 根际、根表和内生示意图 (图片引自Edwards等, 2015)


    图4. 根际土分离流程

    注意事项:
    1. 根系取样,时常会碰到杂质含量较高,取样时需要对杂质进行过滤,避免石块等杂质戳破采样袋等情况的发生,也会给后续提取造成干扰。
    2. 采样时每个采样点的取样深度及采样量应均匀一致。
    3. 根际土收集过程中,摇床震荡时间和强度可根据洗涤难易程度而调整。
    4. 样品保存时避免反复冻融,以免破坏根际土壤菌群结构。

溶液配方

  1. 10 mM PBS溶液(w/v):
    NaCl 130 mM
    Na2HPO4 7 mM
    NaH2PO4 3 mM
    超纯水定容至1 L,调pH 7.4,121 °C高压灭菌15 min,待温度恢复到室温后4 °C保存备用。

致谢

    本工作的顺利开展得益于国家自然科学基金项目(资助号:31722014)和中央非营利性研究基础研究基金(资助号:CAFYBB2020ZY002-1和CAFYBB2019ZA001-3)的经费支持。

参考文献

  1. 秦媛, 潘雪玉, 靳微, 陈连庆 和 袁志林. (2018). 杨树人工林土壤微生物群落4种提取方法比较. 林业科学 54(9):169-176.
  2. 潘雪玉. (2018). 沿海防护林树种促生、耐盐根系真菌筛选及机制初探(硕士学位论文,中国林业科学研究院). 
  3. Berhongaray, G., Janssens, I. A., King, J. S., and Ceulemans, R. (2013). Fine root biomass and turnover of two fast-growing poplar genotypes in a short-rotation coppice culture. Plant Soil 373(1-2): 269-283.
  4. Guo, D., Xia, M., Wei, X., Chang, W., Liu, Y., and Wang, Z. (2008). Anatomical traits associated with absorption and mycorrhizal colonization are linked to root branch order in twenty-three Chinese temperate tree species. New Phytol 180(3): 673-683.
  5. Lacercat-Didier, L., Berthelot, C., Foulon, J., Errard, A., Martino, E., Chalot, M. and Blaudez, D. (2016). New mutualistic fungal endophytes isolated from poplar roots display high metal tolerance. Mycorrhiza 26(7): 657-671.
  6. Mulia, R. and Dupraz, C. (2006). Unusual fine root distributions of two deciduous tree species in southern France: What consequences for modelling of tree root dynamics? Plant and Soil 281(1-2): 71-85.
  7. Norby, R. J., and Jackson, R. B. (2000). Root dynamics and global change: seeking an ecosystem perspective. New Phytol 147(1): 3-12.
  8. Edwards, J., Johnson, C., Santos-Medellín, C., Lurie, E., Podishetty, N. K., Bhatnagar, S., Eisen, J. A. and Sundaresan, V. (2015). Structure, variation, and assembly of the root-associated microbiomes of rice. Proc Natl Acad Sci U S A 112(8): E911-E920.
  9. Beckers, B., De Beeck, M. O., Weyens, N., Van Acker, R., Van Montagu, M., Boerjan, W., and Vangronsveld, J. (2016). Lignin engineering in field-grown poplar trees affects the endosphere bacterial microbiome. Proc Natl Acad Sci U S A 113(8): 2312-2317.
  10. Beckersz, B., De Beeck, M. O., Weyens, N., Boerjan, W., and Vangronsveld, J. (2017). Structural variability and niche differentiation in the rhizosphere and endosphere bacterial microbiome of field-grown poplar trees. Microbiome 5(1): 25.
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Copyright: © 2021 The Authors; exclusive licensee Bio-protocol LLC.
引用格式:何兴华, 杨预展, 袁志林. (2021). 野外树木根系取样及根际土收集操作规程. Bio-101: e2003655. DOI: 10.21769/BioProtoc.2003655.
How to cite: He, X. H., Yang, Y. Z. and Yuang, Z. L. (2021). Protocol for Sampling of Root and Rhizosphere Soils from Trees in Natural Fields. Bio-101: e2003655. DOI: 10.21769/BioProtoc.2003655.
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