仪器设备

个人电脑/服务器 (操作系统：Windows 10/Mac OS 10.12+/Linux Ubuntu 18.04+；CPU：2核+；内存：8G+；硬盘：> 10 GB，且大于10倍原始数据大小)，网络访问畅通。

软件和数据库

1. R语言环境，下载适合自己系统的4.0.2版：https://www.r-project.org/
   
2. R语言开发环境，用于执行流程，下载适合自己系统的RStudio 1.3.1056：https://www.rstudio.com/products/rstudio/download/#download
3. (可选) 仅Windows系统安装，提供Git Bash命令行环境的GitForWidnows 2.28.0：http://gitforwindows.org/
4. 扩增子分析流程USEARCH v10.0.240 (Edgar, 2010) https://www.drive5.com/usearch/download.html
   
5. 扩增子分析流程VSEARCH v2.15.0 (Rognese et al., 2016) https://github.com/torognes/vsearch/releases
   
6. 易扩增子流程EasyAmplicon v1.10 (Zhang et al., 2018 and 2019; Chen et al., 2019; Huang et al., 2019; Liu et al., 2020; Qia et al., 2020a and 2020b)：https://github.com/YongxinLiu/EasyAmplicon
   
7. 核糖体数据库RDP v16 (Cole et al., 2014)：http://rdp.cme.msu.edu/
   
8. (可选) 核糖体数据库GreenGene数据库(gg) 13_8 (McDonald et al., 2011)：ftp://greengenes.microbio.me/greengenes_release
   
9. (可选) 核糖体数据库SILVA v123 (Quast et al., 2013)：http://www.arb-silva.de
   
10. (可选) 转录间隔区(ITS)数据库UNITE v8.2 (Nilsson et al., 2019)：https://unite.ut.ee/
    
11. (可选) Windows版下载工具wget：http://gnuwin32.sourceforge.net/packages/wget.htm
    

软件安装和数据库部署

注：以下的软件安装和使用均在64位Windows 10系统中演示，Linux/Mac中不同的地方会有说明，流程代码提供有Mac版本 (pipeline_mac.sh)。

Windows系统需要安装GitForWindows (http://gitforwindows.org/) 提供Git bash环境支持常用Shell命令。Linux/Mac系统自带Bash命令行工作环境。
以64位Windows 10系统为例，我们先安装R/RStudio软件，再把本流程 (EasyAmplicon/目录) 保存于C盘中，然后根据需要下载数据库至指定目录即完成部署。
注：代码行添加灰色底纹背景，其中需要根据系统环境修改的部分标为蓝色。

1. 流程运行环境R和RStudio
   依次安装适合系统的最新版R语言 (https://www.r-project.org) 和RStudio (https://www.rstudio.com/products/rstudio/download/)。注意操作系统用户名不要使用中文，否则会影响R语言使用。
   
2. 批量安装依赖R包
   流程会调用数百个R包，使用时可自动安装。但由于网络或系统等个性原因经常出现下载或安装失败，可以使用中根据提示手动安装缺失R包。本文推荐直接下载我们预编译好的R包合辑 (http://nmdc.cn/datadownload)，替换至R包所在目录即可，详见常见问题1。
   
3. 易扩增子流程EasyAmplicon
   访问https://github.com/YongxinLiu/EasyAmplicon，选择Code—Download ZIP下载并解压，如保存于C盘并确保目录名为EasyAmplicon。如在RStudio的Terminal中可使用git下载流程：
           git clone git@github.com:YongxinLiu/EasyAmplicon.git
   
4. (可选) 扩增子流程依赖软件
   EasyAmplicon依赖的Windows/Mac/Linux版本软件已经保存于EasyAmplicon中的win/mac/linux目录中，如果出现问题，可按如下方法手动安装。
   USEARCH下载页https://www.drive5.com/usearch/download.html，选择适合自己系统的10.0.240版本 (不要下载最新版，因为有更多功能使用受限)，如Windows版本保存至EasyAmplicon目录中的win目录中，解压后改名为usearch.exe。Linux/Mac系统需下载到环境linux/mac目录，解压后改名为usearch，并添加可执行权限(chmod +x usearch)。VSEARCH下载页面https://github.com/torognes/vsearch/releases，选择适合自己系统的最新版下载，接下来操作与USEARCH类似。Windows系统还需下载wget程序(http://gnuwin32.sourceforge.net/packages/wget.htm) 至win目录。
   
5. (可选) 16S核糖体基因物种注释数据库
   16S扩增子测序分析，常用RDP/SILVA/GreenGene数据库进行物种注释，可以从上述数据库官网下载并整理为USEARCH使用的格式，此处推荐从USEARCH官网 (http://www.drive5.com/sintax) 下载USEARCH兼容格式的数据库。默认流程使用体积小巧的RDP v16数据库 (rdp_16s_v16_sp.fa.gz)，并已保存于usearch目录中。可选GreenGenes 13.5 (gg_16s_13.5.fa.gz)和SILVA (silva_16s_v123.fa.gz) 数据库，可根据需要下载并保存于usearch目录中。此外，如果要开展PICRUSt和Bugbase功能预测分析，还需要使用GreenGenes数据库13.5中按97%聚类的OTU序列 (己保存于流程gg目录中97_otus.fas ta.gz)。可选手动下载GreenGenes官方数据库 (ftp://greengenes.microbio.me/g reengenes_release)，解压后选择其中的97_otus.fasta保存于gg目录下即可。
   
6. (可选) ITS物种注释数据库
   如果研究真菌或真核生物采用转录间隔区 (Intergenic Transcribed Spacer) 测序，需要使用UNITE数据库，目前最新版已经保存于usearch目录(utax_reference_dataset_all_04.02.2020.fasta.gz)。如流程中数据库没有及时更新，可在UNITE官网 (https://unite.ut.ee/) 下载最新版适合USEARCH的注释数据库。官方数据库存在格式问题，详细常见问题2。
   

实验步骤