基于BIOLOG的微生物群落碳代谢功能分析   

材料与试剂

1. 称量纸
2. 枪头
3. V型槽
4. 新鲜土
5. KH₂PO₄
6. K₂HPO₄
7. 磷酸缓冲液 (pH 7.0) (见溶液配方) 
8. BIOLOG ECO板
   

仪器设备

1. 振荡机
2. 移液器
3. 灭菌锅
4. BIOLOG自动读板仪 (Emax precision microplate reader, Molecular Devices, USA) (图1)
   
   
   图1. BIOLOG自动读板仪
   

实验步骤

注：以土壤样品为例 (林先贵，2012)。

1. 称取10 g新鲜土置于100 ml灭菌0.05 M磷酸缓冲液中，70 r/min左右振荡30分钟。
2. 在超净台中吸取1 ml稀释液加入有9 ml无菌缓冲液的试管中，制成10^-2的稀释液，同此法稀释到10^-3稀释度 (图2. A) 。
3. 将10^-3的稀释液倒入灭菌的V型槽中 (图2. B) ，用8通道移液器向BIOLOG ECO板 (生态板) 孔中分别添加150 μl稀释后的悬液 (图2. C)，每个土壤样品3次重复。也可以根据不同的试验目的，选择不同类型的BIOLOG微孔板，包括BIOLOG GP板 (革兰氏阳性细菌板) 、BIOLOG GP板 (革兰氏阴性细菌板) 、BIOLOG FF板 (真菌板)。
4. 将加入样品的微平板置于25 °C恒温培养，分别在培养24、36、48、60、72、84、96、108、120、132、144小时后使用BIOLOG读板仪读取各孔在750 nm和590 nm波长下的光吸收 (图2. D)。可以根据样品调整不同的培养时间进行读数。
5. 将数据导出，计算AWCD，获得AWCD随时间变化的曲线图。选取合适的时间点，将数据转入SPSS、SAS等统计软件进行多样性指数的计算和主成分分析 (Chojniak et al., 2015) 。
   
   
    图2. BIOLOG法分析流程
   
   平均吸光度AWCD，可以表征微生物群落对碳源利用的总的能力
   
   
   其中A_i为第i孔的相对吸光度，A_A1为A1孔的相对吸光度。
   
   Shannon指数H’，用于评估微生物群落功能的丰富度
   
   其中P_i为第i孔的相对吸光值与整个平板相对吸光值总和的比率。
   
   Simpson指数D，用于评估微生物群落功能优势度的指数(Anne E.Magurran, 2011)
   当群落为无穷大群落时，计算公式如下：
   
   其中P_i为第i孔的相对吸光值与整个平板相对吸光值总和的比率。
   当群落为有限群落时，计算公式如下：
   
   其中A_i为第i孔的相对吸光度，N是相对吸光值总和。
   
   McIntosh多样性指数D (Anne E.Magurran, 2011)
   
   
   Mcintosh指数U
   基于群落物种多维空间上的Euclidian距离的多样性指数（杨永华等，2000）。
   
   其中ni是第i孔的相对吸光值，N是相对吸光值总和。
   
   Mcintosh均匀度
   
   其中N是相对吸光值总和, S为发生颜色变化的孔的数目。
   

结果与分析

近地层臭氧浓度升高对麦田土壤微生物碳转化功能的影响 (余永昌，2011)
我们利用Biolog ECO板，分析了近地层臭氧浓度升高 (O₃-FACE) 4年后对麦田土壤微生物碳转化功能的影响。可以发现，臭氧浓度升高下的AWCD曲线于培养132小时达到平台期，而对照条件下的AWCD曲线平台期出现在168小时。从培养60小时起直到培养180小时，臭氧浓度升高下的AWCD值都高于对照处理，培养96小时时高出对照31.6% (图3)。说明臭氧浓度升高提高了麦田土壤微生物对碳源底物的利用能力，刺激了麦田土壤微生物的碳代谢活性，这可能是因为臭氧浓度升高增加了土壤水溶性有机碳含量进而刺激土壤微生物的活性所致。根据96小时的光吸收值，计算得到麦田土壤微生物群落的Shannon、Simpson和McIntosh 指数 (表1) ，可以发现，臭氧浓度升高4年后，土壤微生物群落碳代谢功能的丰富度和优势度都没有显著变化，但是均匀度显著增加，可能暗示臭氧浓度升高会导致土壤中非优势菌对碳源底物代谢能力的提高。


图3. 麦田土壤微生物群落平均吸光值的变化 (AWCD) 随培养时间的变化
注：FACE，臭氧浓度升高条件；Ambient，对照条件

表1. 近地层臭氧浓度升高 (O3-FACE)对麦田土壤微生物群落功能多样性指数的影响


利用96小时的吸光度，进行主成分分析，结果如图4所示。臭氧浓度升高和对照条件下土壤微生物群落的碳源利用在主成分1 (Principal component 1, PC1) 和主成分2 (PC2) 上发生显著分异，说明臭氧浓度升高对麦田土壤微生物群落的碳代谢功能产生显著的影响。PC1对区别碳源利用类型的贡献率约为45%，PC2的贡献率约为20%，两者之和约为65%。


图4. 麦田土壤微生物碳源利用特性的主成分分析
注：FACE，臭氧浓度升高条件；Ambient，对照条件

表2. 导致O3-FACE麦田土壤微生物群落碳源利用特性发生变化的主要碳源类型


进一步分析了与主成分1和主成分2具有较高相关系数的碳源种类，如表2所示。对PC1贡献较高的18个碳源中有9个属于糖类物质，3个属于氨基酸底物及其衍生物，3个属于脂肪酸和脂类和3个属于代谢中间产物和次生代谢物。其中贡献最高的是D-纤维二糖，属于糖类物质，是主要的纤维素水解产物。对PC2贡献较高的7个碳源中有3个属于糖类物质，1个属于氨基酸底物及其衍生物，2个属于脂肪酸和脂类，还有1个属于代谢中间产物和次生代谢物。贡献率最大的是肝糖，也属于糖类物质。肝糖的主要生物学功能是作为动物和细菌的能量储存物质。因此，臭氧浓度升高条件下，导致麦田土壤微生物群落碳源利用特性发生变化的主要是糖类物质。

溶液配方

注：需要提前灭菌的试剂和器物。

1. 磷酸缓冲液 (pH 7.0)
   称取KH₂PO₄ 2.65 g和K₂HPO₄ 6.96 g加蒸馏水至1,000 ml, 121 °C高压灭菌20 min后，4 °C保存。
   其他材料准备：5 ml移液器，称量纸，1 ml枪头，V型槽等。
   

致谢

感谢余永昌博士提供BIOLOG技术的分析案例！感谢国家自然科学基金面上项目 (41977045) 的资助！

参考文献

1. 林先贵. (2012). 土壤微生物研究原理与方法. 高等教育出版社,170-171.
2. 余永昌. (2011). 近地层臭氧浓度升高对稻麦轮作农田土壤碳转化功能微生物的影响. 中国科学院研究生院博士学位论文, 第五章.
3. Anne E. Magurran. (2011). 生物多样性测度. 张峰译.科学出版社,70-76.
4. 杨永华, 姚健, 华晓梅. (2000). 农药污染对土壤微生物群落功能多样性的影响. 微生物学杂志, 20(2): 23-25.
5. Chojniak, J., Wasilkowski, D., Paza, G., Mrozik, A., and Brigmon, R. (2015). Application of Biolog Microarrays Techniques for Characterization of Functional Diversity of Microbial Community in Phenolic-contaminated Water. International Journal of Environmental Research 9:785-794.