河湖着生硅藻样品采集、永久玻片制作及鉴定   

材料与试剂

1. 样品瓶
2. 硬质牙刷
3. (可选) 刀片
4. 圆形塑料片 (直径约6 cm)
5. 100 ml量筒
6. 1,000 μl和100 μl移液器吸头
7. 2 ml离心管
8. pH试纸
9. 载玻片和盖玻片
10. 无尘布
11. 浓硫酸溶液
12. 浓硝酸溶液
13. 稀盐酸
14. 重铬酸甲饱和溶液
15. 无水乙醇及95%乙醇溶液
    
16. 蒸馏水
17. Naphrax树胶
18. 二甲苯
19. 镜油
20. 树胶溶液 (见溶液配方)
    

仪器设备

1. 剪刀
2. 10 ml玻璃试管及金属试管架
3. 1,000 μl和100 μl移液器
4. 平口镊子
5. 水浴锅
6. 通风橱
7. 离心机
8.  (可选) 加热板
9. 光学显微镜
   

实验步骤

一、样品采集

1. 合适的基质：直径6~20 cm的鹅卵石为最佳选择，实际情况中，也可以选择其他尺寸的石块，或沉水植物及挺水植物的水下部分茎段。
2. 样品的收集：首先轻轻冲洗基质，去除表面松散的附着物，使用固定面积的圆形塑料片 (直径约6 cm) 覆盖在基质上，使用硬质牙刷刷去塑料片覆盖以外的所有附着物；取另一牙刷 (或刀片) 刷取并收集塑料片覆盖下的附着物，装入样品瓶中；至少重复采集5份平行样进行混合，记录总体积，并立即加入甲醛固定剂固定保存，使其在样品中的最终浓度为4%。
3. 通过采集整株沉水植物或挺水植物水下部分植物茎段，直接刷取或剪成合适长度放入样品瓶中，加入蒸馏水快速摇晃，记录采样面积并加入甲醛溶液固定保存。

1. 测量固定硅藻样品的体积；
2. 视各样品浓度，取1~2 ml于厚壁玻璃试管中，放置在金属试管架上；
3. 将水浴锅设置为85~90 °C，放置于通风橱中；
4. 将试管架置于上述水浴锅中，并加入与样品等体积的浓硫酸溶液，加热0.5 h；
5. 沿试管壁加入1~3滴浓硝酸溶液 (此反应比较猛烈，会产生大量棕色气体)；待反应减弱或无反应时，加入与样品等体积的浓硝酸溶液，连续热水浴8 h以上；
6. 反应完毕并冷却后，缓慢从水浴锅中取出试管架，置于试验台上，用1,000 μl移液器吸去上清；
7. 加入0.5~1 ml重铬酸甲饱和溶液，摇匀后静置12 h；
8. 将上述混合液转移至2 ml离心管中，不足2 ml则需加入蒸馏水定容至2 ml；
9. 将适用于2 ml离心管的离心机转速设置为737.5 × g，离心30 min，去上清，再次加入蒸馏水定容至2 ml并摇匀，同等条件下再次离心，重复4~5次 (朱蕙忠等，2000)；
10. 待所有样品上清均为透明，且pH值为7后，加入95%乙醇溶液，定容至步骤2中的原始样品体积；
11. 取稀盐酸洗过、浸泡在无水乙醇中的盖玻片 (2 cm*2 cm)，用无尘布擦干后置于水平桌面上备用；
12. 将步骤10中的样品摇匀后，使用100 μl移液器迅速吸取中间层溶液40 μl，垂直滴在盖玻片正中间，样品自动均匀扩散至整个盖玻片表面，待乙醇完全挥发干燥，或放置中加热板上加热干燥；
13. 取树胶溶液40 μl，缓慢滴在干净的载玻片中间，使用平口镊子将上述固定有样品的盖玻片反盖在树胶溶液上，树胶溶液均匀扩散，如有气泡，使用牙签把气泡挤出，或使用加热板加热后去除气泡。贴上包含样品信息的标签并置于通风处干燥2~3天。若有树胶溢出，可使用牙签或手术刀将溢出的教剥离掉，达到便于观察和美观的效果。至此，着生硅藻永久玻片制成，等待镜检 (BS EN 13946, 2014)。

1. 确定分类标准：根据数据使用的需求确定鉴定到种或属水平，采用与研究区域相关的植物区系命名系统或国家级的硅藻名录、图册等权威资料作为分类参考标准；
2. 镜检：将制作好的着生硅藻永久玻片置于光学显微镜下，低倍镜下寻找目标硅藻，然后在高倍镜下 (1,000倍) 使用油镜进行鉴定和计数，带有相差或微分干涉功能的显微镜为佳；
3. 计数：按行格法或视野法计数硅藻壳瓣数 (一个细胞为两个壳瓣)，计数总数不低于400 (BS EN 14407, 2014)，计数表格如表1所示；
   
   表1. 着生硅藻定量检测记录表
   
   
   
   
   
4. 质量控制：同一批样品中随机选取不低于10%的样品在同等条件下进行重复计数，两次结果的误差均在15%以内，则本次计数结果有效。

注意事项

1. 加入浓硫酸和浓硝酸时应缓慢、沿试管壁加入，避免反应剧烈而溢出。
2. 水浴锅长时间高温工作时，应有人值守，定时加水，避免烧干。
3. 上清为酸液，需专门废液回收处理。
4. 每次吸取上清酸液时应在不吸到沉淀物的前提下，多去上清，如果沉淀物被搅动，则需重新离心。
5. 配制树胶-二甲苯溶液时，不可剧烈摇晃，避免气泡产生。
6. 树胶彻底干燥、凝固后的永久玻片方可镜检。
   

失败经验

1. 泥沙较多：当样品中泥沙较多时，会在镜检时难以观察。需在“二、永久玻片制作”步骤2中取样时，摇匀后待样品稍沉淀10 s左右，待泥沙较硅藻先沉降再取上层样品；步骤12中也可在摇匀后约10 s再取上层样品制作永久玻片，可有效减少泥沙的影响。
2. 样品浓度低：若最终样品中硅藻细胞密度非常低，会影响数据准确性。需将“二、永久玻片制作”中步骤10所得样品进行离心，加入样品原始体积的1/5至1/2体积的95%酒精溶液，再进行玻片制作，一般不低于100 μl；一并记录该信息用于最后密度计算。
3. 硅藻细胞破碎：若个体较大的硅藻细胞破碎率较高，难以准确计数。需调低“二、永久玻片制作”步骤9中的离心转速，并适当延长离心时间。
   

溶液配方

1. 树胶溶液
   Naphrax: 二甲苯 (v:v) = 1:1
   配制之前将Naphrax树胶置于温水 (> 80 °C) 中加热，使其成为液态后取适量体积到2 ml离心管中，加入等体积二甲苯，轻轻上下颠倒使其充分溶解备用，切勿用力摇晃。
   

参考文献

1. 朱蕙忠, 陈嘉佑. (2000) 中国西藏硅藻. 科学出版社.
2. BS EN 13946. (2014). Water quality: Guidance for the routine sampling and preparation of benthic diatoms from rivers and lakes.
3. BS EN 14407. (2014). Water quality: Guidance for the identification and enumeration of benthic diatom samples from rivers and lakes.