摘要: 2005年Filée等人首次报道了编码主要壳蛋白的g23基因可用于解析海洋水体T4型细菌病毒基因多样性。随后众多研究表明,该基因还可以应用于其他环境中细菌病毒多样性和群落结构组成分析 (王光华等,2020) 。本文介绍了基于g23基因解析土壤和水体环境中T4型细菌病毒多样性的方法,以期为利用该基因及其它分子标记基因解析环境中细菌病毒多样性和群落结构组成提供参考。
关键词: 噬菌体, g23基因, PCR扩增, 克隆测序
材料与试剂
仪器设备
实验步骤
一、土壤DNA提取 采用土壤总DNA进行相关噬菌体标记基因研究,总DNA提取使用Fast DNA® SPIN Kit for Soil试剂盒,操作步骤如下:
三、PCR引物
上述提取的土壤或水体DNA,用1.5%的琼脂糖凝胶电泳和Nanodrop 2000对DNA质量进行检测,合格的DNA采用简并引物MZIA1bis (5'-GAT ATT TGI GGI GTT CAG CCI ATG A-3') 和MZIA6 (5'-CGC GGT TGA TTT CCA GCA TGA TTT C-3') (Filée et al., 2005) 扩增g23基因片段。
四、PCR扩增体系及步骤
PCR反应体系按照50 μl为例:
PCR反应程序 (35循环) :
五、PCR产物纯化
利用1.5%琼脂糖凝胶进行PCR产物电泳检测,参照DNA Marker条带的分子量大小,初步判断扩增条带是否是g23基因片段。根据笔者经验,不同环境样本中g23基因片段大小在350~600 bp之间。将目的片段位置合格的样本,用无菌手术刀切取目的条带,参照胶回收试剂盒的操作说明进行基因片段的纯化,用NanoDrop 2000测定产物浓度后,进行下游实验。
六、克隆、变形梯度凝胶电泳 (DGGE) 及测序
将纯化后的产物连接到质粒pMD18-T (TaKaRa, Dalian, China) 上,导入大肠杆菌Escherichia coli DH5α感受态细胞中,将阳性克隆PCR扩增后,通过DGGE筛选单一条带的方法,去掉重复序列,将单一的克隆产物进行Sanger测序分析。
注意事项
溶液配方
参考文献
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