摘要:对虾养殖系统微生物群落的失调与对虾病害发生的关系逐渐引起了人们的重视,养殖系统微生物组及其生态学过程的研究已成为解决对虾养殖病害问题的重要突破口。微生物组学技术是微生物群落研究的重要手段,其中样品的采集和制备是最为重要的关键环节之一,但目前对虾养殖系统微生物组样品的采集和制备仍无标准化流程。本文介绍了凡纳滨对虾高位池、育苗系统和生物絮团养殖系统中微生物组样品采集和制备的步骤和要点,以期为今后对虾养殖系统中微生物组学的标准化研究提供借鉴。
关键词: 对虾养殖系统, 微生物组学, 样品采集与制备, 标准化流程
材料与试剂
仪器设备
实验步骤
一、 凡纳滨对虾高位池养殖系统微生物样品的采集和制备 本文以典型凡纳滨对虾高位池养殖系统为例(图1),介绍该养殖系统中微生物样品的采集和制备流程(该流程同样适用于土塘生态池、生物絮团养殖池等对虾养殖系统)。养殖期间采集对虾消化道(Xiong et al., 2015;Liu et al., 2019;Guo et al., 2020)和水体(Zhang et al., 2014;Liu et al., 2018;杨坤杰等,2016)微生物样品,具体流程如下:
图1. 实验用对虾养殖高位池
a. 高位池对虾消化道微生物样品的采集和制备
b. 高位池水体微生物样品的采集和制备
二、 对虾育苗系统微生物样品的采集和制备 凡纳滨对虾幼体发育包括无节幼体(nauplius)、蚤状幼体(zoea)、糠虾幼体(mysis)和仔虾早期(early postlarvae)四个阶段(图6)。由于对虾幼体较小,很难从虾体中分离完整的肠道,因此采集整只虾体测定微生物组。本文以标准化温室育苗体系(4 m × 5 m × 1.3 m,图7)为例,介绍该体系中微生物样品的采集与制备,具体步骤如下(参考Zheng et al., 2017, Xue et al., 2018, Duan et al., 2020,Wang et al., 2020):
三、 生物絮团微生物样品的采集和制备 本文以代表性生物絮团养殖系统为例(图8),介绍该养殖系统中生物絮团微生物样品的采集和制备过程(Huang et al., 2020),具体步骤如下:
结果与分析
按照本实验流程进行微生物样本的收集和DNA提取,可以得到DNA完整性和纯度较高的样本。合格DNA样品结果如下:1)琼脂糖凝胶电泳显示DNA样本条带单一且明显或轻微弥散,无明显或轻微降解,无或轻微杂质和RNA污染,无或轻微杂带和胶孔滞留,(图9A);2)采用Qubit™ 4核酸定量荧光计测定核酸浓度,核酸浓度 ≥ 20 ng/ul,核酸总量≥10 ug,1.6 < OD 260/280 < 2.0, OD 260/230 > 2.0。不合格样品结果为:琼脂糖凝胶电泳显示DNA样本条带出现严重降解或杂质污染且主条带不明显(图9B);核酸总量 ≤ 0.2 ug。 图9. DNA电泳结果。A:合格DNA样本,条带自左至右依次为5,000 bp DNA marker,水体样本、消化道样本、幼体样本和絮团样本的微生物基因组DNA;B:不合格样本的DNA
失败经验
致谢
本工作承国家863项目(2012AA092001)、国家自然科学基金(31672658)、宁波市农业重大专项(2017C110001)、浙江省自然科学基金(LY18C030002)和浙江省教育厅科研项目(Y201839299)的资助。感谢王凯、熊金波、路正、陈和平和王一农老师对本工作的指导和帮助;感谢宁波大学张德民教授课题组历届同学,特别是从事对虾微生物组研究的裘钱玲琳、吴金风、郑嘉来、胡常巨、杨坤杰、刘紫丹、陈伟、刘佳佳、王思鹏、杜世聪等同学对该方法的持续完善。
参考文献
附录1:
QIAamp® Fast DNA Stool Mini Kit操作步骤
附录2:
DNeasy® Power Soil® Kit操作步骤
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