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窖泥样品采集与核酸提取   

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摘要:中国白酒是世界六大蒸馏酒之一,其酿造过程独特,涉及多种微生物的相互作用及代谢。白酒酿造环境已经成为一种我国独有的特殊生态环境,受国内外的广泛关注。浓香型白酒是中国白酒三大香型之一,窖泥是浓香型白酒特征性风味物质-己酸乙酯代谢必不可少的环境。本方法针对窖泥特殊的厌氧环境,采用厌氧袋完成窖泥样品的采集,并进行窖泥宏基因组的提取及保存。本方法对研究白酒酿造微生物多样性及功能有重要价值。

关键词: 中国白酒, 窖泥, 样品采集, 宏基因组提取

材料与试剂

  1. 厌氧产气袋 (MGC/三菱瓦斯化学,catalog number: C-11) 
  2. 自封袋 (Asone/亚速旺,catalog number: ASO-4-536-07) 
  3. 枪头 (碧云天Beyotime, catalog numbers: FTIP010, FTIP200, FTIP01C) 
  4. 离心管 (Nest/耐思,catalog numbers: 602052, 620011, 615001) 
  5. Parafilm封口膜 (Parafilm, catalog number: PM996) 
  6. 玻璃珠 (425~600 μm) (Solarbio/索莱宝,catalog number: G8080-100g) 
  7. 10% SDS Solution (Macklin/麦克林,catalog number: D885207-250ml) 
  8. NaCl (国药集团化学试剂有限公司,中国,分析纯)
  9. Tris-HCl (pH 8.0) (Macklin/麦克林,catalog number: D885212-250ml) 
  10. 三水合乙酸钠 (Macklin/麦克林,catalog number: S817983-500g) 
  11. Tris饱和酚 (pH > 7.8) (上海源叶,catalog number: R21022-100ml) 
  12. 氯仿 (国药集团化学试剂有限公司,中国,分析纯) 
  13. 异戊醇 (国药集团化学试剂有限公司,中国,分析纯) 
  14. 无水乙醇 (国药集团化学试剂有限公司,中国,分析纯) 
  15. RNase A (Solarbio/索莱宝,catalog number: R8021-25) 
  16. DEPC水 (上海源叶,catalog number: S30710-500mL) 
  17. 琼脂糖 (BIOWEST,catalog number: 111860) 
  18. Buffer Z缓冲液 (见溶液配方) 
  19. 3 mol/L NaAc溶液 (pH 5.2) (见溶液配方)

仪器设备

  1. 移液枪 (Eppendorf/艾本德, 货号:3120000267\3120000305\3120000224)
  2. 离心机 (Eppendorf/艾本德,model: 5804) 
  3. 制冰机 (斯科茨曼,model: AF103AS) 
  4. 超低温冰箱 (THERMO/赛默飞,model: ULTS1490) 
  5. BeadBeater珠磨式研磨器 (Biospec, catalog number: 3110BXEUR) 
  6. 电泳仪 (Bio-Rad/伯乐,catalog number: 164-5050) 
  7. 凝胶成像仪 (MIULAB/米欧仪器,catalog number: GIS-500) 
  8. NanoDrop 8000分光光度计 (THERMO/赛默飞,catalog number: YQ1633128264) 
  9. pH计 (Asone/亚速旺,catalog number: C1-054-01)

实验步骤

一、窖泥样品采集

以浓香型白酒窖池为例,分别采集窖壁、窖底三个不同空间位置的窖泥。为消除窖池不同位置窖泥的异质性,每个位置取不同位置的三个样品为对照,取样点示意图如图1。为了尽量保证窖泥厌氧状态,窖泥打孔采集后尽快放入装有厌氧产气袋的自封袋中。每个点取20 g样品。

1. 窖池窖泥样品采集示意图
1~3为窖壁上部窖泥,4~6为窖壁中部窖泥,7~9窖池底部窖泥。

二、窖泥DNA的提取

  1. 取1 g窖泥样品,悬浮于1 ml buffer Z溶液中。
  2. 混匀后,转移到加有0.3 g玻璃珠 (425~600 μm) 的螺帽管中,加入150 μl苯酚,beadbeater细胞破碎仪以最大速度 (3,000 × g ) 击打4 min (每击打80 s,将螺帽管置于冰浴中1 min,共击打三次) 。
    注:此步骤注意戴手套操作,防止苯酚伤害皮肤。此步骤后所有操作要轻柔,以防DNA链断裂。
  3. 击打后加入110 μl 10% SDS,轻轻颠倒混匀后,冰浴10 min,每5 min轻轻颠倒摇匀。
  4. 加入150 μl氯仿:异戊醇 (24:1) 溶液,轻轻混匀,于10,000 × g 离心10 min,吸取上清 (800 μl) ,加入1/10体积的3 mol/L NaAc。
    注:务必不要吸取中间混浊物。
  5. 用等体积的酚、酚:氯仿混合液和氯仿各抽提一次,于10,000 × g 离心10 min,吸取上清 (700、600、500 μl) 。
  6. 加入2倍体积的冰无水乙醇,于-20 °C沉淀2 h以上,10,000 × g 离心15 min,弃上清。
  7. 沉淀于真空冷冻干燥后溶于30 μl无菌水中,加入 20 mg/ml RNase A 3 μl, 37 °C保温15 min;用0.8%琼脂糖凝胶电泳检测提取的基因组质量及片段长度,核酸浓度测定仪 (NanoDrop 8000分光光度计) 测定DNA浓度,-20 °C保存,可用作PCR反应及高通量测序的模板。

溶液配方

  1. Buffer Z缓冲液
    配制成终浓度为150 mmol/LNaCl,10 mmol/L Tris-HCl (pH 8.0) 的混合溶液,灭菌后备用。
  2. 3 mol/L NaAc溶液 (pH 5.2)
    称取408.1 g NaAc·3H2O,溶于约800 ml水中,用冰HAc调节pH值至5.2,加水定容至1,000 ml。

致谢

感谢江南大学酿造微生物与应用酶学研究室的各位老师、同学对本实验方法的帮助和改进。本方法改编自博士论文 (王雪山,2018) ,已在多篇论文中应用 (Wang et al., 2017; Wang et al., 2018) 。

参考文献

  1. 王雪山. (2018). 不同环境清香类型白酒发酵微生物种群结构比较及溯源解析. 江南大学.
  2. Wang, X., Du, H. and Xu, Y. (2017). Source tracking of prokaryotic communities in fermented grain of Chinese strong-flavor liquor. Int J Food Microbiol 244: 27-35.
  3. Wang, X., Du, H., Zhang, Y. and Xu, Y. (2018). Environmental Microbiota Drives Microbial Succession and Metabolic Profiles during Chinese Liquor Fermentation. Appl Environ Microbiol 84(4): e02369-02317.
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Copyright: © 2021 The Authors; exclusive licensee Bio-protocol LLC.
引用格式:王雪山, 杜海, 徐岩. (2021). 窖泥样品采集与核酸提取. Bio-101: e2003386. DOI: 10.21769/BioProtoc.2003386.
How to cite: Wang, X. S., Du, H. and Xu, Y. (2021). Sample Collection and Nucleic Acid Extraction of Pit Mud. Bio-101: e2003386. DOI: 10.21769/BioProtoc.2003386.
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