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In Vitro Fertilization of Chicken Oocytes   

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摘要:【原理】通过人工模拟体内环境(包括营养、温度、pH等)分别使初级卵母细胞在体外培养成熟和精子获能,并在专用的受精溶液中共培养完成受精过程。但是由于鸡生殖生理的特殊性,其体外受精的研究相对比哺乳动物难度较大。【目的和方法】本研究旨在利用体外受精方法生产鸡及进行鸡胚胎移植研究,以期通过此路径实现转基因鸡的生产。【结果】试验结果显示:母鸡产蛋后的30~40 min内有卵子排至卵巢囊内,此时为收集卵子的最佳时期。在44只体外受精的受体母鸡中,有28只产蛋,产蛋率为63.63%(软壳蛋7枚)。其中产出受精蛋8枚,受精率28.57%。孵化后有7枚发育,发育率25.00%。有3枚出雏,出雏率为10.71%。尽管孵化率低,但是在8枚受精卵中有3枚孵出小鸡。【结论】以上试验结果说明鸡卵母细胞可进行体外受精过程,为鸡的胚胎操作提供了参考依据。

关键词: , 卵母细胞, 体外受精, 胚胎移植, 胚胎发育

材料与试剂

  1. 试验鸡
    来自江苏省家禽研究所试验场10~12月龄产蛋高峰期的SR96黄羽母鸡和狼山黑羽母鸡。
  2. 硫贲妥钠麻醉(上海新亚药业有限公司,批号:9902102)
  3. 青霉素(Sigma, catalog number: P3032)
  4. 链霉素(Sigma, catalog number: P4333)
  5. 冰醋酸
  6. 醋酸钠
  7. NaHCO3
  8. 磷酸氢二钾
  9. 葡萄糖
  10. 蔗糖
  11. NaCl
  12. KCl
  13. CaCl2
  14. NaHCO3
  15. C-2精子稀释液成份(见溶液配方)
  16. 改良的 Ringer’s液配方(见溶液配方)

仪器设备

  1. 孵化箱(无锡设备厂,型号:鸣凤4820型)
  2. 培养箱(南京实验仪器厂,型号:HG303-4K型)

实验步骤

  1. 精液采集
    采取7~14月龄的隐性白羽公鸡的精液。使用血细胞计数板计数,在400倍镜下观察,整个视野中布满精子,精子间几乎无缝隙,则精子密度判定为“密”,精液密度为“密”(25.6 ± 1.2)×108/ml,活力为0.9。(依据精子活力评定方法,即400倍镜视野中有90%以上的精子做直线前进运动,则精子活力评定为0.9)精液用含有硫酸链霉素1 g/L和青霉素5,000 IU/L的C-2精子稀释液1:1稀释(详见溶液配方部分)。孵育在38.5 °C培养箱中,30分钟之内使用 (Tanaka et al., 1994)。
  2. 确定取卵时间
    本试验采用产蛋高峰期母鸡,均在人工补光(夜间开灯)和自然采光相结合的条件下饲养。选择产蛋周期长的母鸡,在母鸡产蛋后的不同时间段即30~40 min、50~60 min、90 min以上等三个时间段内收集卵黄卵,确定适宜的取卵时间段 (Petters R, 1992)。
  3. 实验分组与处理
    1. 阴性对照组:20只母鸡,从产蛋后30~40 min未受精鸡的喇叭口或漏斗部收集未受精的卵子,按IVF方法步骤体外操作后移回母鸡输卵管内,这一组用来测定未受精蛋孤雌生殖的程度。
    2. 试验1组:
      1)
      体外受精-体内发育试验
      母鸡在产蛋后15 min(上午6:00~7:00)或20 min(上午8:00~9:30)用硫贲妥钠麻醉(2.5-4.5 mg/kg,约5~10 min);
      2)
      在躯体左侧倒数第一和第二根肋骨之间开4~6 cm长的切口,用装有PBS的巴氏吸管冲洗卵巢囊回收卵子,将卵子用金属勺取出。每个卵子单独收集放置于含有PBS的培养皿中,一切操作均在无菌环境中进行;
      3)
      收集的卵子利用含有60~70 ml改良的Ringers液中(详见溶液配方部分)清洗两遍,并置于60~70 ml新鲜Ringers液中;
      4)
      分别取0.1 ml、0.2 ml、0.5 ml、1.0 ml稀释后的精液滴加在胚珠上,并在41 °C的条件下培养15~20 min,使其体外受精;
      5)
      利用60~70 ml的Ringers溶液清洗受精卵两遍以除去多余的精子,并单个置于盛有新鲜Ringers液的烧杯中,待移;
      6)
      受精卵移植用上述同样的手术方法,将母鸡输卵管喇叭口拉出,撑开,清洗过的受精卵从烧杯灌入张开的喇叭口,轻轻摇动输卵管喇叭口,使受精卵移向输卵管膨大部移动,轻轻放回卵巢囊中,缝合切口。
      注:不要在输卵管内部留有空气,并缩短手术时间以避免对母鸡的刺激。整个手术在无菌条件下进行。在卵移植入输卵管的第二天,收集的蛋完整且为硬壳者,放入孵化箱中标准条件下孵化。
    3. 试验2组:
      将体外受精体外发育试验10枚卵用于体外培养试验,母鸡产蛋后30~40 min内手术法取卵,体外受精的步骤同试验1,卵子体外受精15 min后,弃去Ringers液,添加新鲜蛋白,其量足够覆盖卵(40 ml),随后用保鲜膜盖在烧杯上封口,然后在温度为38.3 °C左右,湿度为50%~60%条件下孵化24 h,观察卵是否受精发育。

结果与分析

  1. 取卵时间的确定
    从表1可以看出:母鸡在产蛋后的30~40 min内开刀,排出的卵子72%(36/50)在卵巢囊中,此时收集卵比较适宜。产蛋后50~60 min取卵,60%(18/30)已进入输卵管,仅40%(12/30)在卵巢囊中。90 min后,排出的卵基本上均在子宫中或泄殖腔中,此时收集卵不合适(图1和2)。然而,在试验过程中,我们注意到如果母鸡产蛋时间是在上午7:00或7:30之前,则排下一个卵的时间间隔较短,大多数在产蛋后的30 min或40 min内排卵,此时开刀可以获得适时的卵。如果母鸡在上午7:30以后产蛋则排卵时间间隔较长一些,大多数在产蛋后40 min~50 min内排卵。9:30以后产蛋的母鸡,排卵时间跨度较大,确定较适宜的取卵时间比较困难。


    图1卵子收集手术操作过程


    图2 卵子收集手术操作过程示意图
    (1)将鸡保定并且麻醉,在躯体左侧倒数第一和第二根肋骨之间,沿肋骨平行方向切开4—6cm的切口;(2) 用金属钩,将切口处拉开使其切口撑开;(3)用装有PBS的巴氏吸管冲洗卵巢囊回收卵子;(4)将卵子用金属勺取出;(5)缝合切口。

    表1. 不同取卵时间的情况
    取卵时间产蛋后30~40 min产蛋后50~60 min产蛋后90 min以上
    试验鸡(只)503010
    排卵情况卵巢囊内或(未排)卵巢囊内或(子宫内)子宫内或(泄殖腔内)
    排卵数(枚)36(14)12(18)10(0)

  2. 体外受精-体内发育试验结果
    试验1组中4组不同精液给量的体外受精和胚胎发育结果如表2所示。从表2中可以看出:总计44只体外受精母鸡中,于移植第二天产下28枚蛋,其中硬壳蛋21枚,软壳蛋7枚。证明鸡卵可在体外受精,移回体内能正常发育受体母鸡成功产下受精种蛋(表2)。在用不同精液量(0.1~1.0 ml)的4个组之间,硬壳蛋的产生率差异不显著(P>0.05)。而受精率在0.1 ml与0.2 ml 、 0.5 ml 、 1.0 ml 组之间差异显著(P<0.05),0.5 ml 和1.0 ml 组之间差异不显著(P>0.05)。分析结果中不难看出:0.1 ml 精液给量组在体外受精时较适宜,在不浪费精液的情况下,即可达到受精目的。虽然每一个组里都有受精蛋,然而,只有在0.1 ml 和0.5 ml 精液的两个组中,3枚受精蛋孵出了小鸡(10.71%)(图3),它们出壳后均健康,在0.2 ml 组中2枚受精蛋在孵化过程中发育1d后死亡,在1.0 ml 组中1枚发育到第11d时死亡,在此试验中,20只未受精卵,移植后产下6枚蛋,孵化后未见有发育的鸡胚,证明没有孤雌生殖。在表2结果中还显示:卵子在15~20 min可受精,。在此试验中,阴性对照组的结果显示,母鸡未受精卵移植后,未见有受精蛋产出。孵化后未见有发育的鸡胚,证明无孤雌生殖 (Howarth B. Jr., 1970)。



    图3. 体外受精后的鸡胚发育

    表 2. 不同精液量对受精率、胚胎发育率和出雏率的影响
    精液量移植卵数(枚)产蛋数(个)受精率(%)胚胎发育率(%)出雏率(%)
    0.11510(4)30.00(3/10) *20.00(2/10)10.00(1/10)
    0.5115(1)40.00(2/5)40.00(2/5)0
    0.5119(2)22.22(2/9)22.22(2/9)22.22(2/9)
    17425.00(1/4)25.00(1/4)0
    总计442828.57(8/28)25.00(7/28)10.71(3/28)
    对照组2010000
     注:产蛋数内括号中的个数表示软壳蛋数;用t检验进行差异显著性分析, *表示差异性显著。

  3. 体外受精-体外发育试验结果
    试验2组中鸡卵体外受精后体外培养结果显示:10枚卵中,1枚受精,培养后发育到明暗区形成,但是比正常的明暗区形成时间要晚一些,以后没有进一步发育,说明体外受精卵可以在体外培养发育。但在本实验中,体外培养受精卵时,每只受精卵加入40 ml 新生蛋的卵白悬浮,在普通培养箱37°条件下进行培养,对其它条件如浓蛋白和稀蛋白比例、pH值、孵化环境等还需进一步研究探索。

溶液配方

  1. C-2精子稀释液成份
    冰醋酸, 0.02 ml
    醋酸钠, 10 g
    NaHCO3, 0.15 g
    磷酸氢二钾, 0.15 g
    葡萄糖, 10 g
    蔗糖, 40 g
    蒸馏水加至100 ml
  2. 改良的 Ringer’s液配方
    NaCl, 145 mmol/L
    KCl, 2.68 mmol/L
    CaCl2, 2.68 mmol/L
    NaHCO3, 0.24 mmol/L
    硫酸链霉素, 1 g/L
    青霉素, 5000 IU/L

致谢

我们感谢李碧春, 陈国宏, 王克华, 丁家桐, 赵东伟, 孙寿永等人与本方案相关的前期研究工作。

参考文献

  1. Tanaka, K., Wada, T., Koga, O., Nishio, Y. and Hertelendy, F. (1994). Chick production by in vitro fertilization of the fowl ovum. J Reprod Fertil 100(2): 447-449.
  2. Petters, R. (1992). Embryo development in vitro to the blastocyst stage in cattle, pigs and sheep. Animal Reproduction Science - ANIM REPROD SCI 28: 415-421.
  3. Howarth, B., Jr. (1970). An examination for sperm capacitation in the fowl. Biol Reprod 3(3): 338-341.
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Copyright: © 2022 The Authors; exclusive licensee Bio-protocol LLC.
引用格式:左其生, 张亚妮, 李碧春. (2022). 鸡卵母细胞体外受精. Bio-101: e1010959. DOI: 10.21769/BioProtoc.1010959.
How to cite: Zuo, Q. S., Zhang, Y. N. and Li, B. C. (2022). In Vitro Fertilization of Chicken Oocytes. Bio-101: e1010959. DOI: 10.21769/BioProtoc.1010959.
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