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Isolation, Culture and Identification of Chicken Embryonic Stem Cells    

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摘要: 【原理】胚胎干细胞(Embryonic stem cells, ESCs)是从早期囊胚内细胞团中发现、能在体外培养的一种高度未分化细胞,它具有发育成各种细胞的潜能。ESCs 可用于研究细胞癌变机理和新药物的筛选。[目的]本实验旨在建立鸡ESCs分离、培养及鉴定体系,为以ESCs 的体外培养与遗传修饰为技术平台的家禽转基因研究提供技术支持。【方法】用药匙法从新鲜受精蛋中分离获取鸡ESCs,利用鸡ESCs因子培养基进行培养。获得的鸡ESCs通过形态学观察、碱性磷酸酶(Alkaline phosphatase, AKP)染色和胚胎阶段特异性表面抗原(Stage specific embryonic antigen 1, SSEA-1)染色等方式进行鉴定。【结果】无饲养层培养体系体外培养鸡ESCs能稳定传代至第6代,传代后的ESCs克隆呈AKP阳性和SSEA-1(FITC标记的羊抗鼠的二抗)阳性,说明ESCs保持未分化的状态。【结论】本实验建立了鸡ESCs 无饲养层培养体系,并成功维持未分化状态,保持其各方面生物学活性,为鸡ESCs 的基因修饰和表观遗传修饰奠定基础。

关键词: , 胚胎干细胞, 分离, 培养, 鉴定

材料与试剂

  1. 离心管
  2. 玻璃吸管
  3. 新鲜受精蛋(扬州翔龙禽业发展有限公司)
  4. Knockout DMEM (Gibco, catalog number: 10829018)
  5. 胎牛血清(Gibco, catalog number: 10099141)
  6. β-巯基乙醇(Sigma, catalog number: M3148)
  7. 丙酮酸钠(Gibco, catalog number: 11360-070)
  8. L-谷氨酰胺(sigma, catalog number: 59202C)
  9. 非必需氨基酸(Sigma, catalog number: M7145)
  10. mLIF(Millipore, catalog number: ESG1106)
  11. bFGF(Sigma, catalog number: F0291)
  12. hSCF(Sigma, catalog number: S7901)
  13. 鸡血清(Gbico, catalog number: 16110-082)
  14. 青链霉素(Solarbio, catalog number: P1400-100)
  15. 碱性磷酸酶染色试剂盒(索莱宝,货号:G1480)
  16. SSEA-1(Biolegend, San Diego, CA; dilution ratio 1:100)
  17. 4%多聚甲醛(Solarbio, catalog number: P1110)
  18. Triton X-100(索莱宝,货号:T8200)
  19. Tween-20(索莱宝,货号:T8220)
  20. 新洁尔灭
  21. ESCs因子培养基(见溶液配方)[1,2]
  22. 1% Triton(见溶液配方)
  23. 封闭液(见溶液配方)
  24. PBS-T(见溶液配方)

仪器设备

  1. 镊子
  2. 药匙
  3. 培养皿
  4. 325目钢筛
  5. 微量移液器
  6. 台式低速自动平衡离心机(湖南湘仪实验室仪器开发有限公司,TDZ4-WS)
  7. 荧光倒置显微镜(OLYMPUS,IX51)
  8. 超净工作台

实验步骤

一、ESCs的分离

  1. 取新鲜受精蛋,依次用新洁尔灭,75%酒精将鸡蛋表面清洗干净,置于超净工作台中。
  2. 利用钝端镊子对准鸡蛋的赤道面进行开口,弃去上端蛋壳。
  3. 左手握着下端蛋壳,右手用钝端镊子紧贴蛋壳壁旋转一圈,将蛋清去除,游离蛋黄。
  4. 利用药匙拨动蛋黄,找到胚盘,眼科剪刀沿着胚盘边缘卵黄膜剪成四边形或三角形,用钝端镊子夹起四边形或三角形卵黄膜(包含胚盘)的一角,小心取出放入含PBS(37 °C左右)的60 mm细胞培养皿中。
  5. 轻轻晃动培养皿,注意观察胚盘情况,直至圆形胚盘从卵黄膜上脱离出来。
  6. 利用玻璃吸管将胚盘置于PBS溶液中清洗3遍,收集胚盘至15 ml离心管。用玻璃吸管充分吹散胚盘呈单细胞悬液。
  7. 用325目钢筛过滤细胞悬液,高速1,000 x g离心6-8 min,收集沉淀,加入ESCs因子培养基,充分吹散重悬,计数,以5×106个细胞接种于60 mm培养皿,置于37 °C,5% CO2培养箱中培养12 h,进行细胞差速贴壁培养。

二、ESCs的培养
  1. 弃去培养12 h的皿中上清,用微量移液器吸取ESCs因子培养基冲刷培养皿底部来收集细胞悬液,置于15 ml离心管中,吹散。
  2. 台式低速自动平衡离心机高速1,000 x g离心6-8 min。
  3. 弃去上清,收集细胞沉淀,加ESCs因子培养基,微量移液器充分吹散重悬。
  4. 台式低速自动平衡离心机低速550 x g离心6-8 min后弃去上清。
  5. 加入ESCs因子培养基吹散重悬,以5×106个细胞重新接种于60 mm细胞培养皿,37 °C 5% CO2培养箱培养。

三、ESCs的鉴定
  1. 利用倒置显微镜观察鸡ESCs的生长情况和形态特征。
  2. 碱性磷酸酶(Alkaline phosphatase, AKP)活性鉴定:
    1. 取生长良好的ESCs,吸出60mm培养皿中的原培养液,缓慢加入PBS溶液,轻柔漂洗3遍。
    2. 缓慢加入AKP固定液固定3分钟,吸出后PBS轻柔漂洗1遍。
    3. 缓慢加入ALP孵育液,避光15-20分钟,吸出后PBS轻柔漂洗1遍。
    4. 缓慢加入核固红染色或者甲基绿染色液复染3-5分钟,吸出液体。
    5. PBS清洗1遍,置于倒置显微镜下观察。
  3. SSEA-1间接免疫荧光鉴定[3]
    1. 取生长良好的ESCs,吸出原培养液,缓慢加入PBS溶液,轻柔漂洗1遍。
    2. 缓慢加入4%多聚甲醛固定30分钟,缓慢吸出上清,用PBS进行清洗。
    3. 缓慢加入1% Triton-100透膜处理20分钟,缓慢吸出上清,用PBS轻柔清洗1遍。
    4. 缓慢加入封闭液(10% FBS的PBS)37 °C避光封闭2h。
    5. 缓慢吸出上清,缓慢加入SSEA-1抗体,37 °C孵育2小时或4 °C过夜
    6. 缓慢吸出上清,加入PBS-T清洗3次,每次5 min。
    7. 滴加二抗,37 °C避光孵育2h,吸出上清,PBS-T轻柔清洗3次,每次5min。
    8. 5 ng/μl DAPI染色10分钟后,吸出上清,加入PBS。
    9. 抗荧光淬灭封片剂封片,显微镜下观察。


结果与分析

  1. 鸡ESCs形态观察
    分离后的ESCs进行在因子培养基中进行无饲养层培养并传代,ESCs的细胞形态较小,且培养后传代,逐渐形成鸟巢状(图1)。


    图1. ESCs传至第三代的细胞形态图,→所示为鸟巢状ESCs克隆,标尺:60 μm

  2. 碱性磷酸酶(AKP)活性鉴定
    通过碱性磷酸酶染色试验发现ESCs克隆能够被染色为橘黄色,表现出碱性磷酸酶活性(图2)。


    图2. ESCs的AKP染色鉴定,→所示为鸟巢状ESCs克隆被染成黄色,标尺:20 μm

  3. SSEA-1间接免疫荧光鉴定
    经间接免疫荧光鉴定分析发现ESCs能够通过标记上SSEA-1,表达绿色荧光(图3)。


    图3. ESCs细胞克隆的SSEA-1的鉴定,标尺:50 μm

溶液配方

  1. ESCs因子培养基(郑蒙蒙等,2013)
    Knockout DMEM
    10% FBS
    0.1 mmol/L β-巯基乙醇
    1 mmol/L丙酮酸钠
    2 mmol/L的L-谷氨酰胺
    1%非必需氨基酸
    1,000 IU/mL LIF
    10 ng/mL bFGF
    5 ng/mL SCF
    1%的双抗
    2%鸡血清
  2. 1% Triton
    1% Triton的PBS
    10 μl Triton加入990 μl PBS中。
  3. 封闭液
    10% FBS的PBS
    1 ml FBS加入9 ml的PBS
  4. PBS-T
    0.05% Tween-20的PBS
    5 μl Tween-20加入995 μl PBS中

致谢

本研究得到了国家自然科学基金资助项目(31872341;31572390)、重点科研项目(2017YFE0108000)和江苏省优势学科的资助。感谢张振韬、郑蒙蒙、赵瑞丰、黄晓梅等的研究工作。

参考文献

  1. 赵瑞丰. 鸡CEF重编程成为PGC诱导体系的建立及其迁移归巢功能的研究.扬州:扬州大学.2018.
  2. 郑蒙蒙,李伟,张亚妮,等.鸡胚胎干细胞无饲养层培养体系的建立及其转染体系的优化.中国畜牧杂志, 2013(17):22-26.
  3. Zhang, Z., Elsayed, A. K., Shi, Q., Zhang, Y., Zuo, Q., Li, D., Lian, C., Tang, B., Xiao, T., Xu, Q., Chang, G., Chen, G., Zhang, L., Wang, K., Wang, Y., Jin, K., Wang, Y., Song, J., Cui, H. and Li, B. (2015). Crucial genes and pathways in chicken germ stem cell differentiation. J Biol Chem 290(21): 13605-13621.
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Copyright: © 2022 The Authors; exclusive licensee Bio-protocol LLC.
引用格式:张晨, 赵瑞丰, 郑蒙蒙, 戴建明, 孙红艳, 左其生, 张亚妮, 李碧春. (2022). 鸡胚胎干细胞分离培养及鉴定. Bio-101: e1010954. DOI: 10.21769/BioProtoc.1010954.
How to cite: Zhang, C., Zhao, R. F., Zheng, M. M., Dai, J. M., Sun, H. Y., Zuo, Q. S., Zhang, Y. N. and Li, B. C. (2022). Isolation, Culture and Identification of Chicken Embryonic Stem Cells . Bio-101: e1010954. DOI: 10.21769/BioProtoc.1010954.
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