Depletion of Endogenous Germ Cells of Tree Shrew   

材料与试剂

1. 树鼩（1岁龄雄性树鼩，购买自中国科学院昆明动物研究所灵长类中心)
2. 白消安busulfan（SIGMA，catalog number: B2635）
3. 1 ml注射器（上海康寿，catalog number: INJ-A-01）
4. 二甲基亚砜DMSO（Amresco，catalog number: 0231）
5. 白消安水溶液（见溶液配方）
   

仪器设备

1. 移液器/移液枪（Eppendorf）
2. 超纯水系统（Millipore）
3. 恒温水浴锅（北京水光明医疗器械）
4. 电子天平（乐祺）
5. 分析天平（Mettler Toledo）
   

实验步骤

1. 树鼩准备
   由于树鼩的个体差异和白消安具有一定毒性，在白消安给药后，树鼩会有部分死亡的情况，因此根据实验动物数量需求，准备2倍数量的树鼩。本实验中准备5只1岁龄雄性树鼩。将树鼩装入透气的布袋中，称重并做好记录。
   
2. 配制白消安
   2.1

   将恒温水浴锅设置为37 °C，准备3 ml DMSO和3 ml ddH₂O，在水浴锅中预热至37 °C。
   2.2

   用分析天平称取50 mg的白消安，溶于2.5 ml预热至37 °C的DMSO中，得到20 mg/ml溶于DMSO的白消安溶液，继续在37 °C水浴锅中孵育。
   2.3

   于20 mg/ml的白消安DMSO溶液中加入等体积的预热至37 °C的ddH₂O，得到10 mg/ml的白消安溶液，继续在37 °C水浴锅中孵育。
3. 白消安给药
   3.1

   计算给药体积：前期研究发现，35 mg/kg的白消安可以有效清除树鼩内源的生精细胞。以树鼩体重为150 g为例，需要注射的10 mg/ml的白消安溶液的体积为：(35 mg/kg × 0.15 kg)÷10 mg/ml = 0.525 ml。
   3.2

   戴好厚手套，用手隔着布袋固定树鼩头部，轻轻将树鼩双腿从布袋中拉出，露出腹部，用1 ml注射器，取相应体积的37 °C的10 mg/ml的白消安溶液，腹腔注射对树鼩给药。
4. 白消安处理效果鉴定
   4.1

   白消安给药后30天，戴厚手套抓住树鼩，通过按压树鼩腹部和阴囊探查树鼩睾丸，可以发现白消安给药的树鼩，睾丸体积比未给药的同龄雄性树鼩明显变小。
   4.2

   处死树鼩后，取树鼩睾丸，通过4%PFA固定-石蜡包埋-HE染色，观察树鼩的生精细胞的清除效果。
   注：此步为可选步骤，如果后续要对树鼩注射精原干细胞建立转基因树鼩，那么可以直接通过上一步探查树鼩睾丸大小判断白消安给药是否有效。

结果与分析

树鼩35 mg/kg白消安给药后30天，用氯胺酮麻醉树鼩 (200 mg/kg)，取睾丸进行HE染色，结果见图1 结果显示，白消安给药的树鼩，睾丸体积明显减小。曲细精管内部出现大面积空腔，生精过程被显著抑制。


图 1. 35 mg/kg白消安处理1岁龄雄性树鼩4周后睾丸HE染色

经验总结

1. 配制的白消安水溶液特别容易析出，导致实验失败。
2. 在配制好白消安溶液以后，一定要保持温度37 °C，并且尽快完成腹腔注射。如果树鼩比较多，可考虑单独配制每只树鼩的白消安水溶液，现配现用。
   

溶液配方

白消安水溶液:
配制的白消安终浓度为10 mg/ml，溶剂为预热至37 °C 的1:1的DMSO和ddH₂O。

致谢

相关工作得到了中国科学院 (XDB13000000 和XDA01010203)、云南省 (2015HA038)、NSFC-云南联合基金项目 (U1702284)以及昆明动物所“135”项目资助。利用本研究相似的方案，我们建立了GFP转基因树鼩，相关工作于2017年发表于《Cell Research》（Li et al., 2017）。前期赵旭东、郭颖等的研究系统探索了不同白消安浓度对树鼩生精细胞的清除作用，并优化了最佳的给药剂量，为本实验方案提供了非常有价值的参考（Liu et al., 2017；郑萍等，2014；郭颖，2014）。

参考文献

1. 郑萍, 赵旭东, 季爽, 郭颖 (2014). 利用树鼩精原干细胞建立转基因树鼩的尝试. 树鼩基础生物学与疾病模型，第二十八章：465-475，云南科技出版社。
2. 郭颖. (2014). 不同浓度的白消安对树鼩精子发生过程的影响. 安徽大学硕士学位论文.
3. Li, C. H., Yan, L. Z., Ban, W. Z., Tu, Q., Wu, Y., Wang, L., Bi, R., Ji, S., Ma, Y. H., Nie, W. H., Lv, L. B., Yao, Y. G., Zhao, X. D. and Zheng, P. (2017). Long-term propagation of tree shrew spermatogonial stem cells in culture and successful generation of transgenic offspring. Cell Res 27(2): 241-252.
4. Liu, T., Guo, Y., Yan, L., Sun, B., Zheng, P. and Zhao, X. (2017). Depletion of endogenous germ cells in tree shrews in preparation for spermatogonial transplantation. Exp Ther Med 14(3): 2349-2354.