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Application of An Enzyme-linked Immunosorbent Assay for the Screening of Small-molecule Inhibitors Targeting β-catenin/TCF4 Interaction   

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摘要:在经典Wnt信号通路中,β-catenin/TCF4 (T-cell factor 4) 相互作用在肿瘤生长分化、化疗耐药、转移复发等过程中发挥着重要的促进作用,已成为新型靶向性抗肿瘤药物开发的理想靶标之一。为了高效地筛选抑制β-catenin/TCF4相互作用的苗头化合物,文中基于酶联免疫吸附实验 (enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA) 原理,通过优化GST-TCF4 βBD (β-catenin binding domain) 包被浓度和β-catenin反应浓度,建立ELISA高通量筛选模型并成功应用于苗头化合物的筛选。应用本筛选模型进行高通量筛选,成功筛选到白花丹素具有良好的抑制活性。本文成功地建立了适用于药物高通量筛选的ELISA筛选模型,为靶向β-catenin/TCF4相互作用小分子抑制剂的高效筛选奠定了基础。

关键词: Wnt抑制剂, 酶联免疫吸附实验, β-catenin/TCF4相互作用, 白花丹素

材料与试剂

  1. 96孔酶标板 (Corning, Catalog number: 42592)
  2. 牛血清白蛋白 (Bovine serum albumin, BSA) (Biosharp,Catalog number: 4240GR100)
  3. 小鼠抗His标签单克隆抗体 (中杉金桥,Catalog number: TA-02)
  4. 小鼠抗GST标签单克隆抗体 (中杉金桥,Catalog number: TA-03)
  5. 辣根过氧化物酶 (HRP) 标记的羊抗小鼠IgG (Biosharp, Catalog number: BL001A)
  6. 可溶型单组分四甲基联苯胺 (Tetramethylbenzidine, TMB) 溶液 (TIANGEN, Catalog number: PA107)
  7. H2SO4 (国药试剂, Catalog number: 10021608)
  8. Tween 20 (Sigma,Catalog number: V900548)
  9. DMSO (Sigma,Catalog number: V900090)
  10. 血根碱 (TargetMol公司,Catalog number: 2781)
  11. 白花丹素 (TargetMol公司,Catalog number: 2841)
  12. GST-TCF4 βBD (1~53 aa) 与β-catenin (138~781 aa) 由本室制备和保存
  13. 天然产物化合物库 (TargetMol公司)
  14. ELISA包被液 (见溶液配方)
  15. ELISA终止液 (2 mol/L H2SO4) (见溶液配方)
  16. PBS (见溶液配方)
  17. PBST (见溶液配方)

仪器设备

  1. 多功能酶标仪 (BioTek, CytationTM 5型)
  2. 移液器 (Eppendorf)

软件

  1. GraphPad Prism 5.0

实验步骤

  1. 将0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10 μg/ml GST-TCF4 βBD以100 μl/孔包被于96孔酶标板中,设定3个复孔,4 °C包被过夜。以PBST洗板3次后,再将含5% BSA的PBST溶液以200 μl/孔加入到酶标板中,室温封闭2 h。封闭的酶标板经PBST洗板3次后,以100 μl/孔依次加入小鼠抗GST标签单抗 (1:2,000) 和HRP-羊抗小鼠IgG (1:4,000),室温孵育1 h。以PBST充分洗板后,每孔加入100 μl TMB溶液,室温避光5 min,加入50 μl H2SO4 (2 mol/L)终止反应,以多功能酶标仪检测OD450值。设定包被BSA孔为对照组。
  2. 将2 μg/ml GST-TCF4 βBD以上述方法包被96孔酶标板后,再以100 μl/孔加入0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10 μg/ml β-catenin,室温孵育1 h。再加入小鼠抗His标签单抗 (1:2,000) 和HRP-羊抗小鼠IgG (1:4,000),TMB溶液显色5 min,以多功能酶标仪检测OD450值。同法包被GST孔设定为对照组。
  3. 将GST-TCF4 βBD (2 μg/ml) 以100 μl/孔包被于96孔酶标板中,以100 μl/孔加入0.5 μg/ml β-catenin,各反应体系中含DMSO终浓度为0%、1%、2%、3%、4%、5%,室温孵育 30 min。再加入上述一抗和二抗,室温孵育1 h,多功能酶标仪检测OD450值。
  4. 将GST-TCF4 βBD (2 μg/ml) 以100 μl/孔包被于96孔酶标板中,以100 μl/孔加入0.5 μg/ml β-catenin,室温孵育30 min。设定含30 μmol/L血根碱孔为阳性对照孔 (A板1#–60#),含1% DMSO孔为阴性对照孔 (B板1#–60#)。加入上述一抗和二抗,室温孵育1 h,以多功能酶标仪检测OD450值。设定A板1#~60#孔为阳性对照孔,其OD450平均值为μP,B板1#~60#孔为阴性对照孔,其OD450平均值为μN,按照下述公式计算Z´因子。

  5. 将GST-TCF4 βBD (2 μg/ml) 以100 μl/孔包被于96孔酶标板中,设定三个复孔,4 °C过夜。PBST洗板3次后,将含5% BSA的PBST溶液以200 μl/孔加入到酶标板中,室温封闭2 h。PBST洗板3次后,将0.5 μg/ml β-catenin以99 μl/孔加入到包被GST-TCF4 βBD (2 μg/ml) 的96孔酶标板中,再以1 μl/孔加入小分子化合物 (10 mg/ml),室温孵育30 min。PBST洗板3次后,加入上述一抗和二抗,室温孵育1 h,以多功能酶标仪检测OD450值。设定含1% DMSO孔为阴性对照组,含30 μmol/L血根碱孔为阳性对照组。在初次筛选中,判定抑制率大于50%的小分子化合物为候选苗头化合物。苗头化合物抑制率计算公式如下:

  6. 将候选苗头化合物以0.5 μg/ml β-catenin进行2倍倍比稀释 (起始浓度100 μmol/L,共稀释12个浓度),再加入到包被GST-TCF4 βBD (2 μg/ml) 的96孔酶标板中,室温反应30 min。加入上述一抗和二抗,室温孵育1 h,以多功能酶标仪检测OD450值,以GraphPad Prism 5.0软件拟合苗头化合物的抑制曲线,计算IC50值。

结果与分析

  1. GST-TCF4 βBD包被浓度与β-catenin反应浓度的确定
    实验结果显示,当包被浓度达到2 μg/ml时,其包被反应曲线趋于饱和 (图1A)。设定2 μg/ml作为GST-TCF4 βBD最佳包被浓度,ELISA实验结果显示,包被的 GST-TCF4 βBD与β-catenin的结合反应具有明显的量效关系,但GST不能与β-catenin发生结合反应。当β-catenin反应浓度达到2 μg/ml时,其结合反应曲线趋于平台期,OD450值达 0.66 (图1B)。为了使高通量筛选模型具有更高的灵敏度和信号窗,选择0.5 μg/ml作为β-catenin最佳反应浓度。


    图 1. 最佳包被浓度和反应浓度的确定

  2. DMSO浓度对结合反应的影响
    ELISA实验结果显示,DMSO浓度在5%以内时,其对GST-TCF4 βBD/β-catenin结合反应未产生显著影响,其OD450值为0.45 ± 0.01 (图2)。


    图 2. DMSO浓度对GST-TCF4 βBD/β-catenin结合反应的影响

  3. ELISA筛选模型Z´因子值的确定
    建立的ELISA筛选模型的因子值为0.83,满足了高通量筛选中Z´因子值大于0.5 的基本要求 (图3)。


    图 3. ELISA筛选模型因子值的确定

  4. 小分子化合物的高通量筛选
    应用上述ELISA筛选模型对本室天然产物化合物库 (含500个天然产物) 进行第一轮筛选,以初筛抑制率大于50%为标准,共获得10个候选苗头化合物 (图4A)。在第二轮筛选中,成功筛选到白花丹素 (plumbagin, PLB) 具有良好的抑制活性,其IC50值为4.55 ± 0.27 μM (图4B)。


    图 4. 苗头化合物的筛选. (A)天然产物化合物库的高通量筛选;(B) 白花丹素在ELISA筛选模型中的抑制活性

注意事项

  1. 封闭液体积要大于包被液体积,以达到充分封闭的效果。
  2. 以PBST洗板3~5次,每次2~3 min,阴性对照孔OD450值不大于0.06。实验操作中洗板要彻底,残留的抗体会使复孔之间的OD450值差异增大。
  3. 实验中使用的蛋白质和抗体试剂需要分装,避免反复冻融。
  4. 需要定期对β-catenin进行生物学活性鉴定,长时间冻存会使其生物学活性下降。
  5. β-catenin最佳工作浓度须同时满足信号窗和灵敏度两个要求,如果其浓度过高将使ELISA筛选模型的灵敏度降低,苗头化合物的IC50值偏高。

溶液配方

  1. ELISA包被液
    Na2CO6.36 g,NaHCO3 11.72 g,溶于1 L蒸馏水中,调pH为9.6,4 °C保存Na2CO6.36 g,NaHCO3 11.72 g,溶于1 L蒸馏水中,调pH为9.6,4 °C保存
  2. ELISA终止液 (2 mol/L H2SO4)
    将22.2 ml H2SO4加入到177.8 ml蒸馏水中即可
  3. PBS
    NaCl 8.01 g,Na2HPO1.42 g,KCl 0.201 g,KH2PO0.272 g,溶于1 L 蒸馏水中,4 °C保存
  4. PBST
    NaCl 8.01 g,Na2HPO1.42 g,KCl 0.201 g,KH2PO0.272 g,Tween 20 0.5 ml,溶于1 L蒸馏水中,4 °C保存

致谢

衷心感谢国家自然科学基金 (81703546)、安徽省自然科学基金 (1808085QH265)和安徽省高校自然科学研究重大项目 (KJ2019ZD30) 对本项目的资金支持!应用本实验方案发表的主要论著见付正豪 等,(2021);陈云雨 等,(2019)。

参考文献

  1. 付正豪, 闫干干, 朱小红, 刘晓平, 陈云雨. (2021). 靶向β-catenin/TCF4相互作用小分子抑制剂酶联免疫吸附法高通量筛选模型的优化与应用. 生物工程学报, 37(8): 1-12.
  2. 陈云雨, 牛夏忆, 李妍, 刘晓平. (2019). 基于β-catenin/Lef1相互作用为靶标的新型抗肿瘤药物高通量筛选模型的建立. 生物工程学报, 35(4): 707-717.
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Copyright: © 2021 The Authors; exclusive licensee Bio-protocol LLC.
引用格式:付正豪, 戚海燕, 闫干干, 刘晓平, 陈云雨. (2021). 酶联免疫吸附实验在β-catenin/TCF4相互作用小分子抑制剂高通量筛选中的应用. Bio-101: e1010833. DOI: 10.21769/BioProtoc.1010833.
How to cite: Fu, Z. H., Qi, H. Y., Yan, G. G., Liu, X. P. and Chen, Y. Y. (2021). Application of An Enzyme-linked Immunosorbent Assay for the Screening of Small-molecule Inhibitors Targeting β-catenin/TCF4 Interaction. Bio-101: e1010833. DOI: 10.21769/BioProtoc.1010833.
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