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Preparation of Customized Library in 96-well Plate by JANUS Automatic Liquid Workstation   

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摘要:在大规模初筛结束后,需要将阳性孔的试剂挑选出来组成一个新的亚库,进行第二轮的复筛验证,这个过程涉及定制文库的制备。另外,当初筛的对象不是整个文库,而是散在分布在整库中的一系列孔时,也需要制备定制亚文库用于筛选。本文将以ORF过表达质粒亚文库的定制流程为例,介绍如何从全基因组ORF过表达文库中挑选出感兴趣的质粒,制备成各孔浓度一致、可直接用于整板细胞转染实验的质粒亚文库。此流程同样适用于化合物库、siRNA文库及sgRNA文库等点阵式文库的亚文库定制,具体移液参数可依据不同加样体积及液体性质略作改动。

关键词: 定制文库, 单挑, ORF

材料与试剂

  1. 96孔U底板 (Costar, catalog number: 3879)
  2. 50 μl透明吸头 (Perkin Elmer, catalog number: 6001263)
  3. 可撕铝膜 (安捷伦PlateLoc ,catalog number: 24210-001)
  4. 全基因组ORF文库 (CCSB-Broad Lentiviral Expression Library,Horizon,-80 °C保存)
  5. OptiMEM (Gibco,catalog number: 31985070)

仪器设备

  1. 离心机 (Eppendorf, catalog number: centrifuge 5810R)
  2. Multidrop自动分液器 (Thermo, catalog number: Multidrop Combi)
  3. Handler workstation自动工作站系统* (Perkin Elmer, catalog number: HANDLER WORKSTATION SX 15)
    a. UV灯
    b. HEPA
    c. Janus液体工作站 (8通道独立吸头)
    d. WinPREP®控制软件 (版本号:4.10.0.54)
    注:仅列出系统在本实验中用到的部分仪器设备
  4. 封膜机 (安捷伦PlateLoc)

实验步骤

CCSB-Broad Lentiviral Expression Library以菌液形式冻存在96孔板中,包括~15,000个克隆,涵盖~11,000个基因,整个文库分布在203块96孔板中。我们对整个文库开展了基于96孔板的质粒抽提,制备了人全基因组ORF质粒文库 (整板质粒抽提方法在本书其他相关章节介绍)。本实验的目的是在全基因组ORF质粒文库中挑取出感兴趣基因的质粒至96孔板中 (本文将以43个质粒的挑取为例),同时使用OptiMEM将各孔质粒浓度调整一致,制备成可直接分装并用于高通量细胞转染实验的质粒亚文库 (图1)。


图 1. 实验流程图 OM,OptiMEM母板;SP,ORF质粒文库板;DP,目的板。

一、准备工作:

  1. ORF质粒文库板 (source plate,SP) 准备:
    从-80 °C冰箱取出所需母板 (质粒存储板为96孔U底板),室温下解冻后离心 (转速129 × g,1 min)。
    : 解冻时最好将每块板子摊开解冻,避免堆叠,否则易在封板膜上形成小液珠,离心不能完全去除。
  2. OptiMEM母板 (OM) 准备:
    用Multidrop或排枪向96孔U底板相应数量的孔中加入OptiMEM 200 μl/孔 (本实验中涉及43种质粒单挑,因此在A1-C6孔内加入OptiMEM,即图2中OM板红色孔位)。
    注:OM板的目的是溶液存储,方便液体工作站取液;也可用液体加样槽 (Perkin Elmercatalog number5079598) 代替,死体积相对稍大,按照常规经验加入的液体量需要比实际用量多至少50 ml,在单挑质粒数较多的实验中建议使用加样槽。
  3. Handler workstation:紫外照射20 min。
  4. Handler workstation:HEPA通风10 min。
  5. 将实验所需材料按照程序设置的位置摆放至液体工作站台面上。

二、液体工作站操作流程:

  1. 向目的板 (destination plate, DP) 中加入指定体积的OptiMEM,如表1第6列所示。
    注:本实验最终获得各孔质粒稀释液的体积为100 μl;该体积可根据后续实验的具体需求进行相应调整,同时需考虑到移液体积不低于移液工作站的最小移液精确体积。

    表 1. ORF 质粒定制文库加样表


    Janus工作台面布局及程序步骤 (如图2及视频"OptiMEM加样程序编辑.mp4"所示。因所用吸头量程为1-50 μl,一次吸打不能完成,所以分成2步):
    a. 从OM板的A1-C6孔 (图2红色孔位) 中各吸取50 μl到DP对应孔位 (图2蓝色孔位),吸取时吸头距板底2 mm,分液时吸头距板底0.8 mm。
    b. 从OM板的A1-C6孔 (图2红色孔位) 中各吸取对应体积 (表2第1列) 到 DP板对应孔位 (表2第3列),吸取时吸头距板底1.5 mm,分液时吸头距板底1 mm.
    注:若使用大量程吸头,可一步完成移液。

    视频1. OptiMEM加样程序编辑


    图 2. 加入OptiMEM的Janus工作台面布局及程序步骤

    表 2. OptiMEM 第二步加样表


  2. 向目的板DP中挑取所需的ORF质粒。
    Janus工作台面布局及程序步骤如图3及视频"质粒单挑程序编辑.mp4"所示。每轮挑选台面上可摆放12块SP,所以32块质粒母板需要3轮程序完成挑选;挑选按照表1第1-5列数据对应进行。吸取时吸头距板底1 mm,分液时吸头距板底2 mm。

    视频2. 质粒单挑程序编辑



    图 3. ORF质粒挑取的Janus工作台面布局及程序步骤

三、收尾工作:

  1. 使用结束后的质粒文库板放置于封膜机上封膜 (封膜条件:170 °C,1.2 s),或使用手封膜 (Costar,catalog number: 6570),放回-80 °C冰箱保存。
  2. 制备好的质粒板可直接用于后续整板转染实验,或封膜保存待用。
  3. Janus机械臂回归原位。

注意事项

  1. 分液时采用Blowout模式,参数选择"low volume",有助于将液体吹打干净 (图4红框)。
  2. 吸头丢弃后,设定200 μl水反冲洗注射器,保证再上下一轮吸头时,注射器下不会悬挂液滴 (图5红框)。


    图 4. 分液模式及参数设定


    图 5. 反冲洗注射器设定

致谢

感谢中国科学院分子细胞科学卓越创新中心化学生物学技术平台全体成员的建议和帮助。

参考文献

  1. Yang, X., et al. (2011). A public genome-scale lentiviral expression library of human ORFs. Nat Methods 8(8): 659-661.
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Copyright: © 2021 The Authors; exclusive licensee Bio-protocol LLC.
引用格式:杨卓, 韩帅, 陈铭. (2021). 利用JANUS自动化液体工作站制备96孔板格式定制文库. Bio-101: e1010826. DOI: 10.21769/BioProtoc.1010826.
How to cite: Yang, Z., Han, S. and Chen, M. (2021). Preparation of Customized Library in 96-well Plate by JANUS Automatic Liquid Workstation. Bio-101: e1010826. DOI: 10.21769/BioProtoc.1010826.
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