Microinjection and Fluorescence In Situ Hybridization Assay for Studying mRNA Export in Mammalian Cells   

材料与试剂

1. 显微注射细胞培养皿 (35 mm，内含20 mm直径玻璃底) (Cellvis, catalog number: D35-20-1-N)
2. 1.5 ml离心管 (Biosharp)
3. 50 ml离心管 (Thermo Fisher Scientific, catalog number: 339652)
4. 胎牛血清 (GIBCO, catalog number: 10099141)
5. DMEM培养基 (GIBCO, catalog number: 1210061)
6. 质粒抽提试剂盒 (QIAGEN, catalog number: 27106)
7. 显微注射针 (二氧化硅玻璃针胚管，1.0 mm内径) (World Precision Instruments, catalog number: 1B100F-3)
8. 显微注射标志物 (70 kDa绿色荧光标记葡聚糖) (Life Technologies, catalog number: D7173)
9. 探针 (Invitrogen) （本文中所用探针位特异靶标CJUN骨架质粒pcDNA3.0，aaggcacgggggaggggcaaacaacagatggctggcaactagaaggcacagtcgaggctgatcagcgggt，5'端添加Alexa Fluor 546修饰）
10. KCl (SIGMA, catalog number: P9541)
11. HEPES (SIGMA, catalog number: H3375)
12. NaCl (SIGMA, catalog number: S3014)
13. Na₂HPO₄ (SIGMA, catalog number: S3264)
14. KH₂PO₄ (Fluka, catalog number: 60218)
15. Paraformaldehyde (SIGMA, catalog number: P6148)
16. Trisodium citrate (SIGMA, catalog number: S1804)
17. Formamide (SIGMA, catalog number: F7503)
18. Dextran sulfate sodium salt (SIGMA, catalog number: D4911)
19. Bovine serum albumin (Abcone, catalog number: A23088)
20. Yeast tRNA (Roche, catalog number: 10109525001)
21. Vanadyl ribonucleoside complexes (SIGMA, catalog number: 94740)
22. 10×显微注射缓冲液 (见溶液配方)
    
23. 1× PBS (见溶液配方)
24. 10% PFA (见溶液配方)
25. 50%甲酰胺/1× SSC (见溶液配方)
26. 杂交缓冲液 (见溶液配方)
    

仪器设备

1. CO₂培养箱 (Thermo Fisher Scientific，Forma Water Jacketed CO2 Incubator，3111)
2. 倒置显微镜 (需包含10倍目镜和40倍物镜，需包含荧光光源) (Olympus, model: IX71)
3. 显微操纵器 (Eppendrof, InjectMan, NI-2)
4. 微量自动注射仪 (Eppendorf, FemtoJet, 5247)
5. 拉针仪 (Sutter Instrument, Flaming/Brown Micropipette Puller, P-97)
6. 玻璃毛细管（World Precision Instruments，1B100F-3 ）
7. 冷冻离心机 (Eppendorf, model: 5424R)
8. -80 °C超低温冰箱 (Thermo Fisher Scientific, Heto Ultra Freeze)
9. -25 °C冰箱 (SANYO, model: MDF-U538-C)
10. pH计 (Mettler Toledo, SevenEasy, 8603)
11. 紫外分光光度计 (NanoDrop)
12. 移液器 (Gilson)
    

实验步骤

一、细胞准备

1. 实验前一天将1.2 × 10⁵个HeLa细胞接种于35 mm，内含20 mm直径玻璃底培养皿的玻璃底中，培养基体积为400 μl。
2. 细胞置于37 °C，5%二氧化碳的环境中培养超过12小时，待细胞完全铺展开来后用于显微注射。
3. 显微注射操作之前2小时，更换2 ml新鲜的含10%胎牛血清的DMEM培养基。

1. 制备上样枪头（详见参考视频-制备上样枪头）
   
   
   
   视频1. 制备上样枪头
   
   
   1.1

   加热200 μl移液枪头，使其尖端呈熔融状态。
   1.2

   快速拉动熔融态的枪头，使其呈足够细长的管状枪头保证能够将显微注射样品加入显微注射针中（图1）。
   1.3

   室温倒置保存制备完成的上样枪头，备用。
   
   
   图1. 上样枪头
   
   
2. 制备显微注射针（详见参考视频-制备显微注射针）。
   
   
   
   视频2. 制备显微注射针
   
   
   2.1

   根据Flaming/Brown Micropipette Puller，P-97拉针仪说明书，注射针选用孔径为1.0mm的玻璃毛细管，设置合适的拉针程序（PROGRAM=56，HEAT=506，VEL=60，TIME=250），按说明书制备显微注射针。
   2.2

   制备完成的显微注射针室温保存，保存过程中要十分小心，切勿破坏针头部分。

1. 用于显微注射的质粒需要保证纯度，A260/A280≈1.8，A260/A230>2，不能含有蛋白质和盐等杂质。同时质粒DNA需要含有适于真核细胞使用的启动子和多聚腺苷酸化的信号。纯化DNA时推荐使用商品化的高纯度质粒抽提试剂盒，纯化获得的质粒DNA使用NanoDrop测量浓度，保存于-25 °C超低温冰箱中。
   
2. 利用10×显微注射缓冲液、质粒DNA、显微注射标志物和水，配置显微注射溶液。保证显微注射缓冲液终浓度为1×，质粒DNA终浓度为100 ng/μl。显微注射前，溶液需要于冷冻离心机中4 °C，离心40分钟，离心转速为14,500 × g，目的是完全将杂质离心至管底，防止吸取到杂质造成注射时堵针。
   

   试剂	体积/μl
   10×显微注射缓冲液	1
   质粒DNA	X(1 μg)
   10×显微注射标志物	1
   水	8-X
   总体积：10 μl

   
   
3. 利用制备的显微上样枪头，取3 μl（足够注射300个细胞）制备完成的显微注射溶液，加样于显微注射针内（图2）。上样时切勿破坏针头部分。
   
   
   图2. 加样示意图
   
   
4. 将含有样品的显著注射针插入显微注射头中，安装在InjectMan NI-2显微注射仪上，安装时切勿破坏针头部分。
5. 在目镜中找到显微注射针头的影像，调节载物台，使针头影像位于视野正中。
6. 轻柔地操作InjectMan NI-2显微注射仪，使显微注射针头接触到细胞培养皿的玻璃底上断开，立即操作注射仪将显微注射针头收回至不再接触玻璃底部，防止显微注射针头持续断裂。按clean键后，可以看到针头处有气体喷出，即说明针头断裂成功（详见参考视频-断裂显微注射针头）。此步是整个显微注射实验的关键，务必轻柔的操作。针头断的过大，显微注射时细胞易胀破；针头断的过小，显微注射时针头易堵。
   
   
   
   视频3. 断裂显微注射针头-成功
   
   
   
   视频4. 断裂显微注射针头-失败
   
   
   
   视频5. 断针成功后按clean键
   
   
7. 调整InjectMan NI-2显微注射仪的参数和细胞位置数字（ti=0.1，pc=60~80），使显微注射针能够刺破 HeLa细胞核，并停留在细胞核内部。
8. 调节InjectMan NI-2显微注射仪的注射压力（pi=100~200），保证每次注射细胞核都能够轻微的膨胀而不会破裂。
9. 注射视野中的所有合适的细胞，然后移动细胞至下一个视野。保证每组实验都能够注射约300个细胞。
10. 将注射完成的HeLa细胞，置于37 °C，5%的二氧化碳的环境中培养所需的时间并固定。

1. 显微注射后，在特定时间点进行荧光原位杂交实验。细胞用1 ml室温的1× PBS洗一次，用200 μl 4%多聚甲醛 (PFA)/1× PBS室温静置固定15 min（后续步骤如无特别说明，操作均在室温条件进行，均为静置孵育或洗涤）。
2. 细胞用1 ml 1× PBS洗三次，然后用200 μl 0.1% Triton X-100室温孵育15 min，渗透细胞膜。
3. 透膜后，细胞用1 ml 1× PBS洗两次，每次10 min；然后用1 ml 50%甲酰胺/1× SSC洗两次，每次10 min。
4. 将荧光标记的特异性探针以1:200稀释于杂交缓冲液中，每个20 mm培养皿加入 200 μl含探针的杂交缓冲液，37 °C避光孵育 12~16个小时（因探针含有荧光标记，此后所有步骤均要在避光条件下进行）。
5. 细胞用1 ml室温的50%甲酰胺/1× SSC洗四次，每次细胞要在50%甲酰胺/1× SSC中停留10 min。
6. 细胞核染色，利用200ul DPAI（0.01 ng/μL/1× PBS）处理细胞2 min。
7. 细胞用1 ml室温的1× PBS洗三次，用Olympus倒置显微镜上的CCD摄像机拍摄图像，若不能拍摄图像，样品在1× PBS中4 °C避光保存。
8. 结果展示
   与脂质体转染比较，显微注射克服了脂质体转染在不同细胞中转染效率不一致、DNA进入细胞核速度慢及具有一定的细胞毒性等问题。如图3所示，显微注射的β-Globin-WT在各个细胞中的表达水平一致，并且细胞核形态都比较正常。而脂质体转染的β-Globin-WT，各个细胞的表达效率不一致、出核的速率不一致，并且细胞核大小不一，说明脂质体的毒性可能影响了细胞状态。
   显微注射结合荧光原位杂交也是检测出核速率及异常转录本出核的有效手段。如图2.A所示，在显微注射含有CJUN目的基因的报告质粒0 min，30 min，60 min之后，利用荧光标记的特异探针检测CJUN mRNA的核质分布。显微注射60 min后能够在细胞质中看到CJUN mRNA的信号，表明CJUN mRNA已有效出核。图2.B展示了β-Globin-WT转录本能够正常出核，而β-Globin-cDNA转录本由于人为移除内含子，缺少剪接事件，不能够有效出核，转录本都阻滞在细胞核中。
   
   
   图 3. 显微注射与脂质体转染荧光原位杂交结果比较
   
   
   图 4. 显微注射及荧光原位杂交检测出核速率及异常转录本出核
   A： CJUN mRNA的出核速率检测。B：β-Globin-WT及β-Globin-cDNA转录本出核效率检测。
   IM: Injection Marker

1. 杂交缓冲液可在4 °C条件保存至少两个月。
2. 用于显微注射的质粒应用超纯水从抽提柱上洗脱，避免用3 M醋酸钠和乙醇沉淀质粒。
3. 探针含有荧光标记，用超纯水溶解至100 ng/μl，分装后保存在-20 °C。杂交探针后的所有步骤均需在避光条件下进行。
4. 进行荧光原位杂交时，将培养皿放在相对湿润的37 °C环境中，避免杂交缓冲液干掉，否则会造成背景偏高。

溶液配方

1. 10×显微注射缓冲液（-80 °C保存）
   

   Reagent	Final concentration
   KCl	1 M
   HEPES	100 mM
   Adjust the pH to 7.4

   
   
2. 1× PBS（室温保存）
   

   Reagent	Dose
   NaCl	8.0 g
   Na2HPO4	1.42 g
   KCl	0.2 g
   KH2PO4	0.27 g
   Add ddH2O to 1 L
   Adjust the pH to 7.4

   
   
3. 10%PFA（-25 °C保存）
   

   Reagent	Dose
   Paraformaldehyde	10.0 g
   1× PBS	80 ml
   Add ddH2O to 100 ml
   Adjust the pH to 7.4

   
   
4. 50%甲酰胺/1× SSC（室温保存）
   

   Reagent	Final concentration
   Sodium chloride	150 mM
   Trisodium citrate	15 mM
   Formamide	50%
   Adjust the pH to 7.0

   
   
5. 杂交缓冲液（4 °C保存）
   

   Reagent	Final concentration
   Sodium chloride	150 mM
   Trisodium citrate	15 mM
   Formamide	50%
   Dextran sulfate sodium salt	100 mg/ml
   Bovine serum albumin	20 ng/ml
   Yeast tRNA	1 mg/ml
   Vanadyl ribonucleoside complexes	3.66 mg/ml
   Adjust the pH to 7.0

   
   

致谢

本文实验方案参考改编自2017年发表在Methods Mol Biol的Microinjection and fluorescence in situ hybridization assay for studying mRNA export in mammalian cells. 所述CJUN mRNA出核检测结果由中科院分子细胞科学卓越创新中心的王可博士提供。感谢国家自然科学基金 (31770880) 和中国科学院特别研究助理资助项目及中国博士后科学基金会特别资助 (2019TQ0337) 对本项目提供的资金支持。

参考文献

1. Chen, S. L., Wang, R. J., Zheng, D. H., Zhang, H., Chang, X. Y., Wang, K., Li, W. C., Fan, J., Tian, B. and Cheng, H. (2019). The mRNA export receptor NXF1 coordinates transcriptional dynamics, alternative polyadenylation, and mRNA export. Mol Cell 74(1):118-131.
2. Fan, J., Kuai, B., Wang, K., Wang, L. T., Wang, Y. M., Wu, X. D., Chi, B. K., Li, G. H. and Cheng, H. (2018). mRNAs are sorted for export or degradation before passing through nuclear speckles. Nucleic Acids Res 46: 8404-8416.
3. Wang, J. S., Chen, J. Y., Wu, G. F., Zhang, H. L., Du, X., Chen, S. L., Zhang, L., Wang, K., Fan, J., Gao, S. X., Wu, X. D., Zhang, S. X., Kuai, B., Zhao, P., Chi, B. K., Wang, L. T., Li, G. H., Wong, C. C. L., Zhou, Y., Li, J. S., Yun, C. H. and Cheng, H. (2019). NRDE2 negatively regulates exosome functions by inhibiting MTR4 recruitment and exosome interaction. Genes Dev 33(9-10):536-549.
4. Wang, K., Shi, M. and Cheng, H. (2017). Microinjection and fluorescence in situ hybridization assay for studying mRNA export in mammalian cells. Methods Mol Biol 1648:95-102.
5. Wang, K., Wang, L. T., Wang, J. S., Chen, S. L., Shi, M. and Cheng, H. (2018). Intronless mRNAs transit through nuclear speckles to gain export competence. J Cell Biol 217: 3912-3929.