Protocol of RNA-fluorescence in situ Hybridization (RNA-FISH) for in vitro Culturing Cells   

研究背景

细胞RNA-FISH是研究目的RNA在细胞中定位的技术，其依据的实验原理是碱基互补配对原则，用带有荧光基团标记的探针去结合细胞中的靶标RNA，最后使用共聚焦显微镜观察荧光信号来确定目的RNA在细胞中的分布。RNA-FISH技术为研究RNA的功能提供了有力的科研工具，在基因诊断、肿瘤遗传学、病毒感染分析等方面发挥了重要的作用 (Cui et al., 2016)。

材料与试剂

1. 12孔细胞培养皿 (Thermo Fisher, catalog number: 150628)
2. 胰酶 (Thermo Fisher, catalog number: 25200072)
3. 移液器枪头 (Axygen, catalog number: T-200-Y)
4. 载玻片 (CITOTEST, catalog number: 188105W)
5. 细胞培养皿盖玻片 (Thermo Fisher, catalog number: H18200)
6. 封口膜 (Parafilm, catalog number: PM996)
7. 1× PBS缓冲液 (Hyclone, catalog number: SH30256.01)
8. 70% 乙醇 (VWR International, catalog number: BDH1164-4LP)
9. 靶向目标RNA的探针 (奥科生物技术有限公司)
10. 37%甲醛 (Richard-Allan Scientific, catalog number: 9311)
11. 20 × SSC溶液 (Ambion, catalog number: AM9765)
12. 甲酰胺 (Ambion, catalog number: AM9342)
13. 硫酸葡聚糖 (Amresco, catalog number: 0198)
14. 封片液 (Invitrogen, catalog number: P36961)
15. DAPI (Invitrogen, catalog number: D1306)
16. 固定液 (见溶液配方)
17. 洗涤缓冲液 (见溶液配方)
18. 杂交液 (见溶液配方)
    

仪器设备

1. 移液器 (Eppendorf，catalog number: 3120000070)
2. 摇床 (其林贝尔，catalog number: TS-1)
3. 4 °C冰箱 (海尔)
4. 37 °C培养箱 (上海一恒，catalog number: LRH-70F)
5. 共聚焦显微镜 (奥林巴斯，catalog number: FV500)
   

实验步骤

一、探针设计和合成
本文通过网页进行探针设计 (https://www.biosearchtech.com/stellaris-designer)。输入序列即可进行探针设计，可以根据需求设计出多条探针。探针的特异性主要通过比对进行验证，在NCBI上对设计出来的探针进行逐条比对，若某一条探针靶向到非靶标区域，则进行排除。本文中，针对LINC00973共设计10条探针，序列见表1 (Wang et al., 2021)。将设计好的探针送去奥科生物技术有限公司进行合成，3＇端加ROX修饰。探针以干粉状态进行合成，合成后稀释成100 µM，于-20 °C冰箱避光保存。

表1. 靶向LINC00973设计的RNA FISH探针(Wang et al., 2021).

1. 将一块干净的盖玻片置于12孔板细胞培养皿底部正中央，然后在该孔中铺上细胞进行培养。
2. 待细胞的密度达到70%左右时，移除培养基，用1 ml 1× PBS洗涤细胞两次去除死细胞。然后加入1 ml固定液，在室温下固定10 min。
3. 移除固定液，用1 ml 1× PBS洗涤细胞两次，每次 5 min。加入1 ml 70%乙醇溶液覆盖细胞，放于4 °C冰箱过夜通透。
4. 移除70%乙醇溶液，加入1 ml洗涤缓冲液，将12孔板置于摇床上，在室温、60 rpm条件下晃动洗涤两次，每次5 min。
5. 取一个空的200 µl枪头盒，枪头架上放一张干净的封口膜，将50 µl加有探针（探针终浓度为125 nM）的杂交液点在封口膜上，然后把盖玻片带有细胞的一面倒扣在杂交液上，使得有细胞的一面直接接触到杂交液。同时在枪头盒里倒入20 ml 2× SSC溶液维持枪头盒中的湿度，防止探针溶液挥发。将枪头盒用封口膜封上，放于37 °C培养箱中避光过夜孵育。
   
   
   
   图1 孵育探针的枪头盒（盒底装有液体，保持湿度，膜上点上探针液，用于细胞孵育）.
   
   
6. 孵育完成后，用镊子将盖玻片小心揭起，转移到装有1 ml洗涤缓冲液的12孔板中，注意让带有细胞的一面朝上，避光孵育30 min。
7. 移除洗涤缓冲液，加入1 ml含DAPI（终浓度为5 ng/ml）的洗涤缓冲液对细胞核进行染色，避光孵育30 min。吸去洗涤缓冲液，加入1 ml 2× SSC溶液，避光孵育10 min。
8. 取一块干净的载玻片，点上少量封片液，然后用镊子轻轻夹起盖玻片，小心去除残存液体，将盖玻片带有细胞的一面倒扣在封片液上。
9. 待完成封片后，室温条件下暗处放置1 h使其自然干燥，最后在共聚焦显微镜下进行成像分析。

结果分析

以实验室已发表文章数据为例。本实验的目的是为了探究lncRNA LINC00973在乳腺癌细胞MDA-MB-231-LM2中的定位。我们对LINC00973进行过表达，过表达效率如图2A所示，野生型和过表达细胞的RNA FISH结果如图2B。绿色为LM2细胞本身带的GFP蛋白，DAPI显示的是细胞核，红色为LINC00973。我们可以看到，红色信号（LINC00973）主要分布在绿色信号（GFP蛋白，可以代表细胞质的位置）的区域，而不是位于蓝色信号（DAPI，标记细胞核位置）的区域内，说明LINC00973在MDA-MB-231-LM2细胞中分布在细胞质中。在过表达LINC00973的LM2细胞中，红色信号增强且依然位于细胞质中，证明靶向LINC00973所设计的探针具有良好的特异性。


图2. RNA-FISH证实LINC00973定位于细胞质中 (Wang et al., 2021).

注意事项

1. 操作过程中要防止盖玻片有细胞一面出现干燥情况。
2. 盖玻片有细胞一面倒扣在杂交液上时，不要有气泡。
3. 在设计探针时，若某条探针虽未完全匹配非靶标基因，但大部分区域匹配到了非靶标基因（比如一条20个碱基的探针，其中15个碱基可以靶向非靶标基因），需要进行进一步判断。若可选择探针较多，则舍弃该探针；若可选择探针不多，则要分析该探针靶向的非靶标基因的表达情况：若非靶标基因表达较高，建议舍弃；若非靶标基因在细胞中表达很低，则可以选用。
4. 为了避免荧光淬灭，所有带荧光的试剂和样品在操作时（包括孵育、洗涤、镜检等步骤）最好在暗处进行，减少在光下暴露的时间。
5.  探针所带荧光基团应根据具体实验要求来进行选择。例如：如果所用细胞本身带有RFP，则不能选用与RFP具有同样激发光的荧光基团。
   

Q&A

1. 杂交结果发现很多背景信号如何优化?
   答：（1）适当延长探针杂交后的洗片时间，要用新鲜配制的洗涤缓冲液。（2）适当减少探针的使用量。
2. 拍摄结果荧光信号弱的原因及改进方法
   答：可能原因以及改进方案如下：（1）探针的灵敏度差低，建议针对同一个靶RNA设计多个探针，也可以适当增加探针使用量。（2）荧光试剂过期或探针杂交后的样品长时间接触强光导致荧光淬灭，建议试剂现配现用，杂交完成后的样品要注意避光存放。
   

溶液配制

1. 固定液
   1× PBS
   3.7%甲醛
2. 洗涤缓冲液
   2× SSC
   10%甲酰胺
3. 杂交液
   2× SSC
   100 mg/ml硫酸葡聚糖
   10%甲酰胺
   

参考文献

1. Cui, C., Shu, W. and Li, P. (2016). Fluorescence In situ Hybridization: Cell-Based Genetic Diagnostic and Research Applications. Front Cell Dev Biol 4: 89.
2. Kishi, J. Y., Lapan, S. W., Beliveau, B. J., West, E. R., Zhu, A., Sasaki, H. M., Saka, S. K., Wang, Y., Cepko, C. L. and Yin, P. (2019). SABER amplifies FISH: enhanced multiplexed imaging of RNA and DNA in cells and tissues. Nat Methods 16(6): 533-544.
3. Urbanek, M. O. and Krzyzosiak, W. J. (2016). RNA FISH for detecting expanded repeats in human diseases. Methods 98: 115-123.
4. Wang, H., Lin, K., Zhu, L., Zhang, S. and Wang, D. (2021). Oncogenic lncRNA LINC00973 promotes warburg effect by enhancing LDHA enzyme activity. Science Bulletin 66(4).