材料与试剂
- 低吸附离心管 (Eppendorf,catalog number: 30108051)
- HeLa细胞 (ATCC, catalog number: CCL-2TM)
- 胎牛血清 (NTC,catalog number: SFBE)
- DMEM高糖培养基 (Hyclone,catalog number: SH30022.01)
- 1x DPBS basic (Dulbecco's phosphate-buffered saline, Gibco, catalog number: C14190500BT)
- 无RNase/DNase超纯蒸馏水 (Thermo,catalog number: 10977023)
- 5-乙炔基尿苷 (5-ethynyluridine,EU;Ribobio,catalog number: C00065) (溶于DMSO配制为0.1 M的母液,可避光保存于-20 °C长达半年)
- 叠氮修饰生物素 (Biotin-azide, Ribobio, catalog number: C00101-50mg) (溶于DMSO配制为0.25 M的母液,可保存于-20 °C长达半年)
- 乙醇 (西陇科学,574,catalog number: 64-17-5)
- TritonX-100 (Sigma-Aldrich,catalog number: T9284)
- 硫酸铜 (CuSO4,Sigma-Aldrich,catalog number: 451657) (溶于无RNase/DNase超纯蒸馏水配制为0.5 M的母液,现配现用)
- 三 (3-羟丙基三氮基甲基) 胺 (Tris(3-hydroxypropyltriazolylmethyl)amine THPTA;Sigma-Aldrich,catalog number: 762342) (溶于DMSO配制为0.25M的母液,可避光保存于-20 °C长达半年)
- 氨基胍盐酸盐 (Aminoguanidine,Sigma-Aldrich,catalog number: 396494) (溶于无RNase/DNase超纯蒸馏水配制为0.5 M的母液,可避光保存于-20 °C长达半年)
- (+)-抗坏血酸钠L (Sodium L-ascorbate,Sigma-Aldrich,catalog number: 11140) (溶于DPBS配制为0.1 M的母液,现配现用)
- 1 M Tris-HCl,pH7.5 (Invitrogen,catalog number: 15567-027)
- 氯化锂 (LiCl;Sigma-Aldrich,catalog number: 62476)
- 十二烷基硫酸锂 (LiDS;Sigma-Aldrich,catalog number: L9781)
- DL-二硫苏糖醇 (DTT;Sigma-Aldrich,catalog number: D0632)
- 无EDTA-蛋白酶抑制剂 (Roche,catalog number: 04693132001)
- RNA酶抑制剂 (RRI; TaKaRa, catalog number: 2313A)
- 链霉亲和素磁珠 (Thermo Fisher Scientific,catalog number: 65602)
- 甲酰胺 (Sigma-Aldrich,catalog number: 47671)
- 1 M Tris-HCl,pH 7.0 (Invitrogen,catalog number: AM9851)
- 蛋白酶K (New England Biolabs,catalog number: P8107S)
- RNase A (Sigma-Aldrich,catalog number: R4875)
- TRI Reagent试剂 (MRC,catalog number: TR-118-200)
- 氯仿 (美国CIL,catalog number: 865-49-6)
- 异丙醇 (大茂,PG13302,catalog number: 67-63-0)
- 糖原 (Roche,catalog number: 10901393001)
- 5 M NaCl溶液 (Invitrogen,catalog number: AM9759)
- 青霉素-链霉素双抗溶液 (Hyclone,catalog number: SV30010)
- 10% 十二烷基硫酸钠溶液 (10% SDS;Invitrogen,catalog number: 24730020)
- 0.5 M EDTA溶液,pH 8.0 (Invitrogen,catalog number: 15575020)
仪器设备
- 10厘米 (cm) 细胞培养皿 (Greiner,catalog number: 664160)
- 二氧化碳培养箱 (Thermo Fisher Scientific,catalog number: 4111)
- 无菌超净工作台 (ESCO,catalog number: ACB-4A1)
- 紫外交联仪 (新芝,catalog number: SCIENTZ 03-II)
- 胰岛素注射器 (BD,catalog number: 328421)
- 2毫升 (ml) 免疫磁珠磁力架 (invitrogen,catalog number: 12321D)
- 垂直混匀仪 (新芝,catalog number: HS-3)
- 小型冷冻离心机 (Eppendorf,catalog number: 5424R)
- 振荡型恒温金属浴 (博日,catalog number: MB-102)
- 转移脱色摇床 (其林贝尔,catalog number: TS-8S)
- 细胞刮 (Greiner,catalog number: 541070)
实验步骤
- 细胞培养和EU处理细胞
在10 cm培养皿中培养HeLa细胞,待HeLa细胞增殖扩大到3皿,并且其密度约为80% 时,加入EU至终浓度为0.25 mM,并继续培养16 h。 - UV交联
- 移除培养皿中的培养基,用4 °C预冷的DPBS清洗HeLa细胞三次,倾斜培养皿,用移液枪彻底去除培养皿中的DPBS残液。
- 将装有冰的大小合适的托盘直接放到交联仪器中,再将去除DPBS后的细胞培养皿平放于冰上,拿出培养皿盖,随后在0.15 J/cm2、254 nm的紫外灯下对细胞进行交联 (培养皿与紫外灯距离大约5-7 cm)。
- 固定细胞
在每一个10 cm培养皿中加入5 ml 90% 的预冷乙醇,并将其平放于冰上固定30 min。 - 配制点击化学反应的反应液 (以下简称为click反应液)
以一个10 cm培养皿为例,按照下表1的顺序配制click反应液。
表1. 配制click 反应液
反应液成分 | 体积 | 母液浓度 |
DPBS | 9.44 ml | --- |
biotin-azide | 10 μl | 0.25 M |
CuSO4 | 6 μl | 0.5 M |
THPTA | 24 μl | 0.25 M |
aminoguanidine | 20 μl | 0.5 M |
sodium L-ascorbate | 500 μl | 0.1 M |
总体积 | 10 ml | --- |
- 细胞透化
- 固定后的细胞用预冷的DPBS洗3次,置于摇床,使用40 rpm的转速,室温左右平摇,每次5 min。
- 在每一个10 cm培养皿中加入5 ml细胞通透液 (见溶液配方),并将其置于冰上,对细胞进行通透处理15 min。
- 细胞通透完成后,用预冷的DPBS洗3次,置于摇床,使用40 rpm的转速,室温左右平摇,每次5 min。
- click反应
移除培养皿中所有的DPBS残液,并在每个培养皿中加入10 ml click 反应液,室温孵育3 min。 - 终止click反应
- 移除培养皿中的click反应液,加入预冷的click反应终止液 (见溶液配方) 清洗细胞3次,置于摇床,使用40 rpm的转速,室温左右平摇,每次5 min。
- 用预冷的 DPBS 清洗细胞2次,置于摇床,使用40 rpm的转速,室温左右平摇,每次5 min。
- 裂解并收集细胞
- 在每一个培养皿中加入 1 ml 裂解缓冲液 (见溶液配方),并将培养皿平放于冰上,充分裂解15 min。
- 用细胞刮将细胞刮下,转移到1.5 ml 离心管中,用27 G的胰岛素注射器反复抽打细胞5次,进一步裂解细胞。
注意:此步骤收集的细胞裂解液可以经液氮速冻保存于-80 °C冰箱,但要避免反复冻融。 - 准备亲和素偶联的磁珠
按照每1 ml细胞裂解液中加入100 μl 亲和素偶联的磁珠的用量准备磁珠,用0.5 ml 裂解缓冲液清洗100 μl磁珠3次,并按照原来珠子混悬液的体积再用同体积的裂解缓冲液重悬。 - 分离RNA-蛋白质复合物
- 充分裂解后的细胞裂解液在12,000 × g,4 °C 条件下离心10 min,吸取上清并转移到一个新的1.5 ml 离心管中。
- 加入与上清等体积的裂解缓冲液稀释,并吸取总体积5% 的样本量至一个新的1.5 ml 离心管中,作为后续质控实验——Western Blotting或者银染的上样阳性对照 (Input)。
- 在稀释后的细胞裂解液中加入前一步骤准备好的磁珠,将此混合物置于4 °C冰箱或者冷库中的垂直混匀仪上旋转孵育2 h,转速为10 rpm。
- 孵育结束后将离心管置于磁珠分离架,静置5 min,待磁珠与溶液分离后,弃上清液。
- 从磁力架上取下离心管,并于每管加入1 ml 裂解缓冲液,完全重悬磁珠后,于4 °C冰箱或冷库的垂直混匀仪上旋转清洗磁珠10 min,转速为15 rpm (之后步骤涉及垂直混匀仪清洗均按照此条件)。
- 清洗磁珠结束后,重复以上步骤d。
- 从磁力架上取下离心管,并于每管加入1 ml 洗涤缓冲液1 (见溶液配方) 重悬磁珠,于4 °C冰箱或冷库的垂直混匀仪上旋转清洗磁珠10 min,重复此步骤2次。
- 参照步骤g,再分别用洗涤缓冲液2 (见溶液配方) 和洗涤缓冲液 3 (见溶液配方) 各清洗磁珠2次。
- 最后一次洗涤结束后,即洗涤缓冲液3洗涤的第2次,从垂直混匀仪上取下离心管,吸取10% 的磁珠-细胞裂解液复合物,用以检测RNA富集的效率,余下的90%用于质谱技术鉴定分离出来的蛋白。
- 分离RNA
- 将含有10% 磁珠的离心管置于磁珠分离架,待磁珠分离完成后,完全移除上清液。
- 每管加入50 μl RNA 洗脱缓冲液 (见溶液配方) 重悬磁珠。
- 将离心管置于90 °C的恒温震荡仪,1000 × g,震荡洗脱5 min。
- 加入等体积 2x 蛋白酶K消化缓冲液 (见溶液配方) 以及100 μg蛋白酶K (母液浓度为20 mg/ml) , 于55 °C恒温金属浴中震荡孵育2 h,转速1000 rpm。
- 孵育结束后,加入 1 ml TRI Reagent试剂,剧烈混合均匀。
- 加入200 μl 氯仿,上下剧烈颠倒混匀约15 s,室温静置5 min。
- 12,000 × g,4 °C离心15 min。
- 用移液器小心吸取上清至一个新的1.5 ml 离心管中, 加入 1 μl 储存浓度为 20 mg/ml 的糖原和等体积的异丙醇, 充分混匀后, 在 -20 °C沉淀RNA过夜。
- 次晨将沉淀过夜的RNA离心,12,000 × g,4 °C离心15 min,移除异丙醇。
- 用75% 的乙醇清洗沉淀,12,000 × g, 4 °C离心15 min,移除乙醇,再重复此步骤一次。
- 用移液器充分移去乙醇,空气干燥RNA至其透明,加入15 μl 无RNase/DNase超纯蒸馏水溶解 RNA 用于以后续 RT-qPCR 及测序分析。
- 分离蛋白质
- 将第10步中余下含有90% 磁珠的离心管置于磁珠分离架,待磁珠分离完成后,完全移除上清液,加入200 μl 蛋白洗脱液 (见溶液配方) 重悬磁珠。
- 加入 100 U 的RNase A,在37 °C的恒温震荡仪上,1000 × g,震荡洗脱1 h,转速为1000 rpm。
- 12,000 × g,4 °C 瞬时离心,随后在95 °C加热器上加热5 min,再置于冰上。
- 12,000 × g,4 °C 离心5 min,将离心管置于磁珠分离架,待磁珠分离完成后,转移上清至一个新的1.5 ml 离心管中,用于后续质谱检测分析。
溶液配方
- 蛋白酶抑制剂溶液:取一片蛋白酶抑制剂片剂,用500 μl 商业化无RNase/DNase超纯蒸馏水溶解,配制成100x 母液,使用时按照1:100的比例加入,可保存于
-20 °C长达半年。 - 细胞通透液:用商品化的DPBS溶液配制终浓度为0.5% Triton X-100 (v/v) 的细胞通透液。
- click反应终止液:用商品化的DPBS溶液配制终浓度分别为0.5% Triton X-100 (v/v) 以及2 mM EDTA的click反应终止液。
- 裂解缓冲液:
用商品化的无RNase/DNase超纯蒸馏水配制终浓度分别如下的裂解缓冲液,可放于4 °C储存,使用前加入DTT、蛋白酶抑制剂 (按照体积比1:100使用) 和RNase抑制剂 (母液浓度为40 U/μl,按照体积比1:200使用),以下是具体配方:
20 mM Tris-HCl, pH 7.5
500 mM LiCl
1 mM EDTA, pH 8.0
0.5% LiDS (w/v)
5 mM DTT (使用前加入) - 洗涤缓冲液1:
用商品化的无RNase/DNase超纯蒸馏水配制终浓度分别如下的洗涤缓冲液,可放于4 °C储存,使用前加入DTT,以下是具体配方:
20 mM Tris-HCl, pH 7.5
500 mM LiCl
1 mM EDTA, pH 8.0
0.1% LiDS (w/v)
5 mM DTT (使用前加入) - 洗涤缓冲液2 :
用商品化的无RNase/DNase超纯蒸馏水配制终浓度分别如下的洗涤缓冲液,可放于4 °C储存,使用前加入DTT,以下是具体配方:
20 mM Tris-HCl, pH 7.5
500 mM LiCl
1 mM EDTA, pH 8.0
5 mM DTT (使用前加入) - 洗涤缓冲液 3:
用商品化的无RNase/DNase超纯蒸馏水配制终浓度分别如下的洗涤缓冲液,可放于4 °C储存,使用前加入DTT,以下是具体配方:
20 mM Tris-HCl, pH 7.5
200 mM LiCl
1 mM EDTA, pH 8.0
5 mM DTT (使用前加入) - RNA 洗脱缓冲液
用商品化的无RNase/DNase超纯蒸馏水配制终浓度分别如下的缓冲液:
10 mM EDTA, pH 8.0
95% formamide - 2x蛋白酶K消化缓冲液:
用商品化的无RNase/DNase超纯蒸馏水配制终浓度分别如下的缓冲液,可放于4 °C储存,使用前加入蛋白酶K,以下是具体配方:
2 mM Tris-HCl,pH 7.0
20 mM NaCl
0.2 mM EDTA,pH 8.0
0.1% SDS
1 mg/ml蛋白酶K (使用前加入) - 蛋白洗脱缓冲液:
用商业化的无RNase/DNase超纯蒸馏水配制终浓度分别如下的缓冲液,现配现用,使用时每个样本加入100 U RNAse A 消化,以下是具体配方:
20 mM Tris-HCl,pH 7.0
1 mM DTT
1% SDS
致谢
该项目得到了国家重点研究开发项目 (2016YFA0100701),广州市珠江科技新星项目 (201610010107) 以及中国科学院青年创新促进会项目 (2015294) 的支持。以下是基于本方法发表的文章Bao, X., Guo, X., Yin, M., Tariq, M., Lai, Y., Kanwal, S., Zhou, J., Li, N., Lv, Y., Pulido-Quetglas, C., Wang, X., Ji, L., Khan, M. J., Zhu, X., Luo, Z., Shao, C., Lim, D., Liu, X., Li, N., Wang, W., He, M., Liu, Y. L., Ward, C., Wang, T., Zhang, G., Wang, D., Yang, J., Chen, Y., Zhang, C., Jauch, R., Yang, Y. G., Wang, Y., Qin, B., Anko, M. L., Hutchins, A. P., Sun, H., Wang, H., Fu, X. D., Zhang, B. and Esteba, M. A. Capturing the interactome of newly transcribed RNA Nat Methods 2018. 15(3): p. 213-220.
参考文献
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- Castello, A., Fischer, B., Eichelbaum, K., Horos, R., Beckmann, B. M., Strein, C., Davey, N. E., Humphreys, D. T., Preiss, T., Steinmetz, L. M., Krijgsveld, J. and Hentze, M. W. (2012). Insights into RNA biology from an atlas of mammalian mRNA-binding proteins. Cell 149(6): 1393-406.
- Baltz, A. G., Munschauer, M., Schwanhäusser, B., Vasile, A., Murakawa, Y., Schueler, M., Youngs, N., Penfold-Brown, D., Drew, K., Milek, M., Wyler, E., Bonneau, R., Selbach, M., Dieterich, C. and Landthaler, M. (2012). The mRNA-bound proteome and its global occupancy profile on protein-coding transcripts. Mol Cell 46(5): 674-90.
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