Nuclear and cytoplasmic isolation and RNA extraction in HeLa cell   

材料与试剂

1. 1.5 ml RNase-free 离心管 (Biosharp)
2. Tirs-base (Sigma, catalog number: T1503-1KG)
3. NaCl (Sigma, catalog number: S3014-1KG)
4. MgCl₂ (Sigma, catalog number: 63068-250G)
5. Igepal CA-630 (Sigma, catalog number: 18896-50ML)
6. Sodium deoxycholate (Sigma, catalog number: D6750-25G)
7. Ribonucleoside Vanadyl Complex, RVC (New England BioLabs, catalog number: S1402S)
8. NaCl (Sigma, catalog number: S3014-1KG)
9. Na₂HPO₄ (Sigma, catalog number: S3264-500G)
10. KCl (Sigma, catalog number: P9541-1KG)
11. KH₂PO₄ (Fluka, catalog number: 60218)
12. 胰酶 (GibcoTM, catalog number: 25200072)
13. TRIzol (Sigma, catalog number: T9424-100ML)
14. 氯仿 (国药试剂)
15. 20mg/ml 糖原 (Sigma, catalog number: G8751-5G)
16. 异丙醇 (Sigma, catalog number: I9030-500ML)
17. 乙醇 (泰坦科技，catalog number: G73537B)
18. Lysis buffer (见溶液配方)
19. Lysis buffer + Sodium deoxycholate (见溶液配方)
20. 1x PBS (见溶液配方)
    

仪器设备

1. 移液器 (Gilson)
2. 载玻片 (世泰，catalog number: 188105W)
3. 冷冻离心机 (Eppendorf, model: Centrifuge 5424 R)
4. 显微镜 (Olympus, model: IX71)
5. -80 °C超低温冰箱 (Thermo Fisher Scientific, model: Heto Ultra Freeze)
6. pH计 (Mettler Toledo, SevenEasy 8603)
7. CO₂培养箱 (Thermo Fisher Scientific, model: Forma Water Jacketed CO2 Incubator 3111)
8. 紫外分光光度计 (Thermo Fisher Scientific, model: NanoDrop 2000)
   

实验步骤

一、细胞核与细胞质分离

1. 对于贴壁细胞：以HeLa细胞为例，取4 × 10⁵个 HeLa 细胞，弃上清，加入250 μl胰酶，放置于CO₂培养箱中37 °C消化5 min，加入1 ml 1x PBS终止消化；对于悬浮细胞：可以直接吹打使细胞脱落进行收集。4 °C，1,000 × g离心3 min，弃上清。
   注：整个实验过程中使用到的所有离心管及枪头需为RNase free。
2. 1 ml Lysis buffer重悬细胞沉淀，将其吹散，力度适宜，并减少气泡产生。冰上放置5 min。
   注：取20 μl样品置于载玻片上，显微镜下观察细胞状态，约80-90%细胞的细胞质已裂，核膜上沾有少量的细胞质残骸 (图1)。冰上放置时间根据细胞种类的不同需要摸索。
3. 4 °C，1,000 × g离心3 min，取上清，即为细胞质组分。
   注：为了得到纯净的细胞质，可将上清4 °C，12,000 × g离心10 min，再次取上清。
4. 1 ml Lysis buffer+ Sodium deoxycholate重悬上一步获得的细胞沉淀，将其吹散，约吹打5-7次，力度适宜，并减少气泡产生。冰上放置4 min。
   注：取20 μl样品置于载玻片上，显微镜下观察细胞状态，几乎所有细胞的细胞质膜破裂，细胞核较第二步要干净，较少细胞质残骸剩余 (图2)。
5. 4 °C，1,000 × g离心3 min，彻底去上清，保留细胞沉淀。
6. 1 ml Lysis buffer 重悬细胞沉淀，4 °C，1,000 × g离心3 min。
7. 彻底去上清，沉淀即为细胞核组分。
8. 细胞核及细胞质组分可各取一部分进行Western Blot，根据指示蛋白的分布情况检测核质分离的效果 (图3)。

1. 取200 μl步骤1-3中所得上清，加入800 μl的TRIzol，迅速混匀。在细胞核沉淀中，加入1 ml TRIzol，迅速混匀。
2. 加入200 μl的氯仿，剧烈震荡15 s，室温静置2 min。
3. 4 °C，12,000 × g离心15 min，样品分相为三层。其中RNA存在于上层水相中。小心取上清450-500 μl转移至新的离心管中。切勿吸取到中间层。
   注：为提高RNA抽提效率，可在体系里加入2 μl糖原。
4. 每个样品中加入500 μl异丙醇，上下颠倒混匀后，-80 °C静置20 min。
5. 4 °C，12,000 × g离心15 min，弃上清，离心管底部可见白色RNA沉淀。
6. 每个样品中加入1 ml DEPC水配制的75% 乙醇，4 °C，7,500 × g离心5 min，尽量吸弃上清，将离心管置于洁净处自然风干至液体不可见。加入10 μlDEPC水溶解RNA沉淀。
7. NanoDrop测定浓度后，将细胞核与细胞质RNA保存于-80 °C冰箱中备用。
8. 细胞核和细胞质RNA可各取一部分进行实时荧光定量PCR，根据指示基因的表达水平判断核质分离的效果 (图4)。

溶液配方

1. Lysis buffer
   Final concentration                                  Stock                     Work (50 ml)
   10 mM Tris-Cl pH = 8.0                            1 M                        0.5 ml
   140 mM NaCl                                             5 M                       1.4 ml
   1.5 mM MgCl₂                                           1 M                        75 μl
   0.5% Igepal                                                10%                       2.5 ml
   Vanadyl ribonucleoside complexes      200 mM                2 mM
   H₂O                                                                                    Add DEPC water to 50 ml
2. Lysis buffer + Sodium deoxycholate
   Final concentration                                   Stock                     Work (50 ml)
   10 mM Tris-Cl pH = 8.0                             1 M                        0.5 ml
   140 mM NaCl                                             5 M                        1.4 ml
   1.5 mM MgCl₂                                            1 M                          75 μl
   0.5% Igepal                                                 10%                       2.5 ml
   0.5% Sodium deoxycholate                     10%                       2.5 ml
   Vanadyl ribonucleoside complexes        200 mM                2 mM
   H₂O                                                                                    Add DEPC water to 50 ml
3. 1x PBS
   Reagent                Dose
   NaCl                      8.0 g
   Na₂HPO₄             1.42 g
   KCl                        0.2 g
   KH₂PO₄                0.27 g
   H₂O                   Add DEPC water to 1 L
   pH                     Adjust the pH to 7.4 with NaOH
   
   
   图1. Lysis buffer 重悬细胞后，显微镜下观察的细胞形态
   图2. Lysis buffer + Sodium deoxycholate 重悬细胞后，显微镜下观察的细胞形态
   图3. Western blot检测核质分离效果，Tubulin和UAP56分别作为细胞质和细胞核的指示蛋白
   图4. qPCR检测核质分离效果，Neat1和GAPDH分别作为细胞核和细胞质的指示基因
   

致谢

感谢中国科学院分子细胞科学卓越创新中心程红课题组的全体成员的建议和帮助。该研究受到国家自然科学基金 (31770880，31800686) 的支持。本文实验方案由程红课题组的王可博士参考优化自2007年发表在Science上名为"A hexanucleotide element directs microRNA nuclear import"的文章。

参考文献

1. Hwang, H. W., Wentzel, E. A. and Mendell, J. T. (2007). A hexanucleotide element directs microRNA nuclear import. Science 315(5808): 97-100.
2. Shi, M., Zhang, H., Wang, L., Zhu, C., Sheng, K., Du, Y., Wang, K., Dias, A., Chen, S., Whitman, M., Wang, E., Reed, R. and Cheng, H. (2015). Premature termination codons are recognized in the nucleus in a reading-frame dependent manner. Cell Discov 1: 15001.
3. Wang, K., Wang, L., Wang, J., Chen, S., Shi, M. and Cheng, H. (2018). Intronless mRNAs transit through nuclear speckles to gain export competence. J Cell Biol 217: 3912-3929.