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Construction of Hi-C Library for Butterfly   

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摘要:Hi-C技术源于染色体构象捕获 (Chromosome Conformation Capture, 3C) 技术,用于分析染色质三维空间结构的一种测序方法。将三维基因组用甲醛交联固定,用内切酶进行酶切后在DNA末端加生物素标记,使DNA与蛋白、蛋白与蛋白分开,然后,提取DNA并打断成小片段,用磁珠捕获带生物素标记的片段进行建库测序,对测序数据进行分析即可揭示染色体的远程相互作用,阐述染色体的三维构象和可能的基因之间的调控关系。该技术广泛用于分化发育机制、突变机制、疾病的发生发展等研究,也是近年来解析染色体水平的参考基因组的一个关键环节。
以枯叶蛱蝶属蝴蝶为例,利用Hi-C技术获得蝴蝶特定发育时期的基因组序列,结合生物信息分析方法,研究全基因组范围内整个染色质DNA在空间位置上的关系,从而获得高分辨率的染色质三维结构信息,为组装蝴蝶的染色体水平的参考基因组提供重要的数据。

关键词: 蝴蝶, Hi-C, 染色质, 三维结构

研究背景

Hi-C (High-through chromosome conformation capture) 技术 (Dekker et al., 2002) 源于染色体构象捕获 (conformation capture, 3C) 技术,以整个细胞核为研究对象,利用高通量测序技术,结合生物信息分析方法,研究全基因组范围内整个染色质DNA在空间位置上的关系,通过对染色质内部全部DNA相互作用模式进行捕获,获得高分辨率的染色质三维结构信息。2009年,Job Dekker研究团队 (Lieberman-Aiden et al., 2009) 首次提出了Hi-C测序的概念,并利用该技术得到人类正常淋巴细胞基因组的三维结构图。通过Hi-C技术可以获得全基因组范围内的互作信息,得到染色体三个层级的三维结构,即常染色质/异染色质 (A/B compartment)、拓扑相关结构域 (TAD)、染色质环 (loop);通过Hi-C技术可建立基因组折叠模型,研究染色体之间相互作用;Hi-C技术可应用于基因组组装、单体型构建等,并可以与RNA-seq、ChIP-seq等数据进行联合分析,从基因调控网络和表观遗传网络来阐述生物体性状形成的相关机制。Hi-C技术在蝴蝶中的应用也越来越广泛,例如,中国科学院昆明动物研究所进化基因组学与基因起源研究团队于2019年利用Hi-C技术结合三代长读长测序技术 (Pacbio) 完成了染色体水平的碧凤蝶 (Papilio bianor Cramer, 1777) 基因组组装 (29条常染色体和1条性染色体),这是首个利用Hi-C技术完成的染色体水平的蝴蝶基因组 (Lu et al., 2019);并于2020年利用Hi-C技术结合三代长读长测序技术 (Pacbio) 和核型实验成功解析了枯叶蛱蝶 (Kallima inachus Doyère, 1840) 染色体水平的高质量基因组 (30条常染色体及Z和W两条性染色体),这是首个组装了W染色体的蝴蝶参考基因组,也是至今组装得最完整的蝴蝶参考基因组 (Yang et al., 2020)
        本文参考Belton等 (Belton et al., 2012; Ma et al., 2015; Nagano et al., 2015; van Berkum et al., 2010) 的方法对非模式动物蝴蝶幼虫进行了Hi-C文库的构建。

材料与试剂

  1. 移液吸头
  2. 离心管
  3. 一次性培养皿
  4. 解剖刀
  5. 解剖剪
  6. 镊子
  7. 血球计数板
  8. Corning cell strainer 40 µm Nylon (BD)
  9. DynaMagTM-2磁力架 (Invitrogen, catalog number: 12321D)
  10. MilliQ ddH2O
  11. Tris饱和酚 (Solarbio, catalog number: T0250-250)
  12. 氯仿 (Mecklin, catalog number: C2432-500ML)
  13. 异戊醇 (Aladdin, catalog number: M116198-500ml)
  14. 琼脂糖 (Biowest, catalog number: 111860)
  15. EDTA (Solarbio, catalog number: E8040-500g)
  16. 1 M Tris-HCl (pH 8.0) (Coolaber, catalog number: SL3080-100mL)
  17. 3 M Sodium acetate (pH 5.2) (Thermo, catalog number: R1181)
  18. 2.5 M Glycine (Biofroxx, catalog number: 1275)
  19. NaCl (Solarbio, catalog number: S8210-500g)
  20. KCl (生工, catalog number: 231-211-8)
  21. Na2HPO4·12H2O (Sigma-Aldrich,catalog number: 1065790500)
  22. KH2PO4 (Macklin, catalog number: P815662-500g)
  23. NaHCO3 (Sigma-Aldrich, catalog number: S8875-500G)
  24. 酚红 (Macklin, catalog number: P6066-100g)
  25. 0.2% Igepal CA-630 (Sigma-Aldrich, catalog number: I8896-100ML)
  26. 100% Ethanol (Merck, catalog number: 459844-2.5 L)
  27. TE Buffer (pH 8.0) (Solarbio, catalog number: T1120)
  28. BSA (Solarbio, catalog number: A8010-5g)
  29. 10% (w/v) Triton X-100 (Tiandz, catalog number: 25-07910)
  30. 10% (w/v) SDS (Simgen, catalog number: 9021100)
  31. RNase A (康为世纪, catalog number: CW0601S)
  32. Tween-20 (Coolaber, catalog number: CT11551-100ml)
  33. 0.25% Trypsin-EDTA (Gibco, catalog number: 25200-072)
  34. Calf serum (ExCell, catalog number: NCD100)
  35. DMEM (BI, catalog number: 14417)
  36. 1× Phosphate-buffered saline (PBS) (pH 7.2) (Cell Signaling, catalog number: 9872L)
  37. 37% Formaldehyde (Sigma Aldrich, catalog number: 1040031000)
  38. Proteinase K (10 mg/ml) (Coolaber, catalog number: SL2074-1mL)
  39. HaltTM Protease Inhibitor Cocltail (100×) (Thermo Scientific, catalog number: 87786)
  40. Klenow DNA Polymerase I (NEB, catalog number: M0210S)
  41. Klenow Fragment (3’ → 5’ exo-) (NEB, catalog number: M0212S)
  42. T4 DNA Ligase (NEB, catalog number: M0202V)
  43. T4 DNA Polymerase (NEB, catalog number: M0203L)
  44. T4 Polynucleotide Kinase (NEB, catalog number: M0201V)
  45. Dpn II (NEB, catalog number: R0543S)
  46. NEBNext Multiplex Oligos for Illumina (NEB, catalog number: E7535S)
  47. 10× NEBuffer 3.1 (NEB, catalog number: B7203S)
  48. 5× Ligation Buffer (Invitrogen, catalog number: 46300-018)
  49. 10× NEBuffer 2.1 (NEB, catalog number: B7202V)
  50. 10× Ligation Buffer (NEB, catalog number: B0202S)
  51. User Enzyme (NEB, catalog number: M5505S)
  52. Agencourt AMPure XP Beads (Beckman Coulter, catalog number: A63881)
  53. VAHTS Adapter for Illumina (Vazyme, catalog number: ND104-01-AM)
  54. VATHS Universal PCR Primer for Illumina (Vazyme, catalog number: ND104-01-AN)
  55. VATHS Index Primer for Illumina (Vazyme, catalog number: ND104-01)
  56. Dynabeads MyOne™ Streptavidin C1 beads (Invitrogen, catalog number: 65001)
  57. 25 mM dNTP mix (TaKaRa, catalog number: SD0304)
  58. 10 mM dATP,10 mM dGTP,10 mM dCTP,10 mM dTTP (Invitrogen, catalog number: 18252015, 18254011, 18253013, 18255018)
  59. 0.4 mM biotin-14-dATP (Invitrogen, catalog number: 19524-016)
  60. Qubit dsDNA HS Assay Kit (Invitrogen, catalog number: Q32851)
  61. Qubit dsDNA BR Assay Kit (Invitrogen, catalog number: Q32850)
  62. Agilent High Sensitivity DNA Kit (Agilent, catalog number: 5067-4626)
  63. Phusion DNA Polymerase (Stratagene, catalog number: 600670-51)
  64. 10× PfuUltra Buffer (Stratagene, 600670-52)
  65. D-Hanks缓冲液



  66. 1× Lysis缓冲液



    --- Stored at 4 °C
  67. Tween Wash Buffer (TWB)



  68. 2× Binding Buffer (BB)



仪器设备

  1. 恒温水浴摇床 (GFL, model: 1092)
  2. 冷冻离心机 (Eppendorf Centrifuge, model: 5810 R)
  3. 体视显微镜 (Nikon, model: SMZ745)
  4. 超声波DNA破碎仪 (Covaris, model: M220)
  5. ThermoMixerF 1.5精巧型恒温混匀仪 (Eppendorf, model: 5384000071)
  6. ProFlex PCR System (Thermofisher, model: 4484075)
  7. QubitTM 4 荧光计 (Invitrogen, catalog number: Q33238)
  8. Agilent 2100 Bioanalyzer System (Agilent, model: G2939BA)

实验步骤

  1. 分离细胞 (Cell Separation)
    1)
    根据实验设计,取末龄枯叶蛱蝶幼虫一只 (取样的个体数量根据可获得的细胞数量决定),剔除肠道内的内容物,用解剖剪将组织剪成小块 (1 mm2),用D-Hanks缓冲液洗涤三次 (洗去组织表面的杂质),转移至离心管中;
    2)
    加入适量0.25% Trypsin-EDTA (以淹没过组织为准),置于37 °C恒温水浴摇床中消化1 h,使细胞分离;
    3)
    将样品置于超净台工作台中进行后续的实验操作,加D-Hanks缓冲液洗涤三次,转移至新离心管中,加入适量0.25% Trypsin-EDTA (以淹没过组织为准,置于37 °C恒温水浴摇床中消化20 min,消化后的组织使用Corning cell strainer 40 µm Nylon过滤收集滤液,并加入一滴Calf serum抑制Trypsin-EDTA的作用;重复上述消化、收集步骤1–2次;
    4)
    加入3-5 ml DMEM (含10% Calf serum) 以终止Trypsin-EDTA消化作用;
    5)
    4 °C 300 × g离心10 min,收集细胞颗粒,弃上清液液;
    6)
    加入5 ml D-Hanks缓冲液,用移液器轻轻吹散细胞沉淀,4 °C 300 × g离心10 min,收集细胞颗粒,弃上清液液;
    7)
    加入1-2 ml 1× PBS (视细胞量),重悬细胞颗粒,用血球计数板计数约1×106–108个细胞后,即可继续进行后续的实验。
    注:不同物种分离细胞所获得的细胞量不同,正式实验之前应进行分离细胞预实验,以便评估可获得的细胞数量。若细胞量远大于1×108时,则加入2 ml 1×
    PBS
    ,减少因细胞量过多而引起的细胞计数误差;若细胞量低于1×108时,则加入1 ml左右的1× PBS以便更好的进行后续实验
  2. 细胞交联 (Crosslinking of Cells)
    1)
    4°C 300 × g离心5 min细胞悬液,收集细胞颗粒,加入1ml 1× PBS轻轻吹打重悬细胞,加入30 µl 37% Formaldehyde溶液 (终浓度大约1%),轻轻混匀,置于垂直混匀仪上室温孵育10 min (此步骤会影响内切酶对DNA序列的消化效率,需要严格控制甲醛浓度和孵育时间);
    2)
    加入120 µl 2.5M Glycine,轻轻混匀,置于垂直混匀仪上室温孵育5 min,冰上静置15 min,以终止交联反应;
    3)
    4°C 300 × g离心5 min收集细胞颗粒;
    4)
    加入1.5 ml预冷的1× PBS,用移液器轻轻吹打混匀,4°C 300 × g离心5 min收集细胞颗粒。
    以上即为交联后样品,可用于接下来的实验,或者-80 °C冻存,冻存样品3个月内使用。
  3. 细胞裂解和染色体消化 (Cell Lysis and Chromatin Digestion)
    1)
    用1 ml预冷的1× Lysis缓冲液悬浮交联的细胞颗粒,并加入10 µl HaltTM Protease Inhibitor Cocltail;
    2)
    冰上静置15 min;
    3)
    4 °C 2,500 × g离心5 min;
    4)
    弃上清液,用500 µl 预冷的1× NEBuffer 3.1 (使用10 × NEBuffer 3.1稀释10倍) 洗涤两次,4°C 2500 × g离心5 min;
    5)
    用360 µl 1 × NEBuffer 3.1悬浮细胞颗粒;
    可选做:吸取18 µl裂解物到一个新的0.2 ml离心管中,作为核染色质完整性对照:
    a)
    加入50 μl的1× NEBuffer 3.1和10 μl的Proteinase K (10 mg/ml);
    b)
    65°C孵育30 min;
    c)
    苯酚-氯仿抽提一遍:加入50 μl的Tris饱和酚,振荡混匀10 min,4 °C 12,000 rpm离心10 min,小心的吸取上层液体加入至新的1.5 ml离心管中;再加入等体积的Tris饱和酚:氯仿:异戊醇 (25:24:1),振荡混匀10 min,4°C 12,000 rpm离心10 min,小心的吸取上层液体加入至新的1.5 ml离心管中;加入等体积的氯仿:异戊醇 (24:1),4 °C 12,000 rpm离心10 min,小心的吸取上层液体加入至新的1.5 ml离心管中;加入2.5倍体积的预冷的Ethanol,-20°C过夜;4 °C 12,000 rpm离心10 min,小心的弃上清;加入400 μl预冷75% Ethanol,反复吹打溶解,4 °C 12,000 rpm离心10 min,小心的弃上清;再加入400 μl 预冷75% Ethanol,反复吹打溶解,4 °C 12,000 rpm离心10 min,小心的弃上清;室温晾干10 min,加入20 μl TE Buffer溶解DNA。
    d)
    加入1 μl RNase A (1 mg/ml) 37°C孵育15 min;
    e)
    提取的DNA用0.75%的琼脂糖凝胶电泳检测其完整性,当DNA完整无拖尾降解,即可进行后续实验。
    6)
    加入38 µl 1% SDS (终体积为380 µl),用移液器轻轻地吹打混匀,避免产生气泡;
    7)
    65°C孵育10 min,孵育完后立即置于冰上;
    8)
    加入43 µl 10% Triton X-100 (总体积423 μl) 以终止SDS的作用 (Triton终浓度为1%),用移液器轻轻地吹打混匀,避免产生泡沫;
    9)
    37°C孵育15 min;
    10)
    加入12 μl 10× NEBuffer 3.1 (总体积435 μl);
    11)
    加入400 U (40 µl,10,000 units/ml) Dpn II (总体积475 μl),置于ThermoMixer Comfort恒温混匀仪中37 °C过夜 (8-11 h)。
  4. 末端加生物素标记 (Marking of DNA Ends with Biotin-14-dCTP)
    1)
    65°C孵育20 min使限制性内切酶失活;
    选做:吸取10 µl到一个新的0.2 ml离心管中作为对照,处理方法如3的步骤5)。
    2)
    准备下表所示反应液:


    注:按表中的顺序依次加入。

    3)
    孵育完后将离心管置于冰上冷却至室温;
    4)
    将60 μl的反应液加入至裂解产物中,此时总体积为535 μl;
    5)
    用移液器轻轻地吹打混匀,避免产生气泡;
    6)
    置于ThermoMixer Comfort恒温混匀仪中23 °C反应4 h (900 rpm,每5 min振荡10 s),完后立即置于冰上冷却。
  5. 平端连接 (Blunt End Ligation)
    1)
    准备下表所示反应液:
    2)




    3)
    将665 µl 反应液加入至含生物素的产物中,此时总体积为1,200 µl;
    4)
    置于ThermoMixer Comfort恒温混匀仪中16 °C反应4 h,间隔振荡。
  6. 反交联 (Reverse Crosslinking)
    1)
    加入50 µl proteinase K (10 mg/ml), 65°C孵育2 h;
    2)
    加入50 µl proteinase K于65°C孵育过夜,此时总体积为1,300 µl。
  7. DNA纯化 (DNA Purification)
    1)
    将反交联产物室温冷却后分成2管,各750 µl,各加入1.2 ml的100% Ethanol和75 µl 3 M Sodium acetate;
    2)
    翻转混匀后,-80 °C孵育15 min;
    3)
    12,000 rpm,4°C离心15 min,置于冰上,并小心弃去上清液;
    4)
    加入800 µl新鲜配制的70% Ethanol洗涤,12,000 rpm,4°C离心5 min,弃去上清液;
    5)
    再用800 µl新鲜配制的70% Ethanol洗涤,12,000 rpm,4°C离心5 min,弃去上清液;
    6)
    室温晾干;
    7)
    加入130 µl TE Buffer溶解 (必要时37 °C孵育15 min加速溶解);
    8)
    使用Qubit™ dsDNA BR Assay Kit检测DNA浓度 (https://www.thermofisher.cn/order/catalog/product/Q32850?SID=srch-srp-Q32850#/Q32850?SID=srch-srp-Q32850),当DNA总量>5 µg即可继续后续实验。
    注: 所获得的DNA样品可于-20°C保存。
  8. 去除末端未连接生物素 (Removal of Biotin from Un-ligated Ends)
    1)
    准备如下反应液:



    2)
    20 °C下孵育4 h;
    3)
    75 °C下孵育20 min终止反应;
    4)
    置于冰上冷却。
  9. DNA打断 (DNA Sonication)
    1)
    用MilliQ ddH2O将步骤8中获得的混合液补至130 µl;
    2)
    用超声波破碎仪将DNA打断至200-300 bp,超声波DNA破碎仪参数设置如下表所示:



  10. DNA片段筛选 (Size Fractionation)
    1)
    将Agencourt AMPure XP Beads提前于室温中平衡30 min;
    2)
    每个离心管中加入500 µl Agencourt AMPure XP Beads,磁力架上静置5 min,弃250 µl上清液,混匀备用;
    注:此步将磁珠浓缩一倍,以确保充分沉淀DNA
    3)
    将打断后的样品体积补至200 µl;
    4)
    加入160 µl Agencourt AMPure XP Beads (0.8×),用移液器吹打混匀;
    5)
    室温下孵育10 min,置于磁力架上待溶液澄清后,将上清液转移至新的离心管中;
    6)
    加入40 µl Agencourt AMPure XP Beads (0.2×) 至上一步所得上清液中,用移液器吹打混匀;
    7)
    室温下孵育10 min,置于磁力架上待溶液澄清后,弃去上清液;
    8)
    加入1 ml新鲜配制的70% Ethanol洗涤磁珠两次;
    9)
    室温晾干,使Ethanol充分蒸发;
    10)
    加入50 µl TE Buffer溶解DNA。
    (可选做) 取样品使用2%琼脂糖凝胶检测打断及片段选择的片段大小范围。
  11. 磁珠捕获携带生物素片段 (Biotin Pulldown with Streptavidin Coated Beads)
    1)
    取150 µl 10 mg/ml Dynabeads MyOne™ Streptavidin C1 beads至1.5 ml离心管中;
    2)
    加入400 µl TWB清洗磁珠,用移液器吹打混匀,置于振荡装置上室温孵育3 min,然后,置于磁力架上回收磁珠,弃去上清液;
    3)
    加入400 µl TWB重悬磁珠,转移至新的离心管中,置于磁力架上回收磁珠,弃去上清液;
    4)
    加入300 µl BB重悬磁珠;
    5)
    加入250 µl TE Buffer和50 µl Hi-C样品;
    6)
    室温下孵育15 min;
    7)
    将离心管置于磁力架上,待溶液澄清后弃去上清液;
    8)
    加入600 µl TWB洗涤磁珠,转移至新的离心管中;
    9)
    将离心管置于Thermomixer Comfort恒温混匀仪上,55 °C振荡孵育2 min,置于磁力架上回收磁珠,弃去上清液;
    10)
    重复洗涤一次;
    11)
    用100 µl 1× Ligation Buffer (10× Ligation Buffer稀释10倍) 重悬磁珠,将产物及磁珠转移至一个新的离心管中,置于磁力架上回收磁珠,弃去上清液;
    12)
    用50 µl 1× Ligation Buffer重悬磁珠。
  12. 末端补平 (End Repair)
    1)
    配制如下反应液:



    2)
    20 °C孵育30 min;
    3)
    将离心管置于磁力架上,待溶液澄清后弃去上清液;
    4)
    加入600 µl TWB清洗磁珠,转移至新的离心管中,将离心管置于Thermomixer Comfort恒温混匀仪上,55 °C振荡孵育2 min。置于磁力架上回收磁珠,弃去上清液;
    5)
    重复步骤4) 一次,加入600 µl TWB清洗磁珠,转移至新的离心管中,将离心管置于Thermomixer Comfort恒温混匀仪上,55 °C振荡孵育2 min。置于磁力架上回收磁珠,弃去上清液;
    6)
    用100 µl 1× NEBuffer 2.1 (10× NEBuffer 2.1稀释10倍) 重悬磁珠,将产物及磁珠转移至一个新的离心管中,置于磁力架上回收磁珠,弃去上清液;
    7)
    最后用40 µl 1× NEBuffer 2.1重悬磁珠。
  13. 末端加 “A” (A-Tailing)
    1)
    配制如下反应液:



    2)
    37 °C孵育30 min;
    3)
    将离心管置于磁力架上,待溶液澄清后弃去上清液;
    4)
    加入600 µl TWB清洗磁珠,转移至新的离心管中,将离心管置于Thermomixer Comfort恒温混匀仪上,55 °C振荡孵育2 min;置于磁力架上回收磁珠,弃去上清液;
    5)
    重复洗涤一次;
    6)
    用100 µl 1× Ligation Buffer (5× Ligation Buffer稀释5倍) 重悬磁珠,将产物及磁珠转移至一个新的离心管中,置于磁力架上回收磁珠,弃去上清液;
    7)
    用40 µl 1× Ligation Buffer重悬磁珠。
  14. 接头连接 (Adaptor Ligation)
    1)
    配制如下反应液:



    2)
    37 °C下孵育30 min;
    3)
    将离心管置于磁力架上,待溶液澄清后弃去上清液;
    4)
    加入600 µl TWB清洗磁珠,转移至新的离心管中,将离心管置于Thermomixer Comfort恒温混匀仪上,55 °C振荡孵育2 min,置于磁力架上回收磁珠,弃去上清液;
    5)
    重复洗涤一次;
    6)
    用100 µl 1× Ligation Buffer (5× Ligation Buffer稀释5倍) 重悬磁珠,将产物及磁珠转移至一个新的离心管中,置于磁力架上回收磁珠,弃去上清液;
    7)
    用40 µl 1× Ligation Buffer重悬磁珠。
  15. User酶处理 (User Enzyme)
    1)
    配制如下反应液:



    2)
    37°C下孵育20 min;
    3)
    将离心管置于磁力架上,待溶液澄清后弃去上清液;
    4)
    加入600 µl TWB清洗磁珠,转移至新的离心管中,将离心管置于Thermomixer Comfort恒温混匀仪上,55 °C振荡孵育2 min,置于磁力架上回收磁珠,弃去上清液;
    5)
    重复洗涤一次;
    6)
    用100 µl 1× NEBuffer 2.1 (10× NEBuffer 2.1稀释10倍) 重悬磁珠,将液体及磁珠转移至一个新的离心管中,置于磁力架上回收磁珠,弃去上清液;
    7)
    用40 µl 1× NEBuffer 2.1重悬磁珠。
  16. PCR扩增 (PCR Amplification)
    1)
    配制如下反应液:



    2)
    PCR扩增程序如下:



  17. PCR产物纯化及片段筛选 (Production PCR and Size Selection)
    1)
    将Agencourt AMPure XP beads提前于室温中平衡30 min;
    2)
    将PCR产物体积补至250 µl;
    3)
    将离心管置于磁力架上,待溶液澄清后弃去磁珠;
    4)
    加入175 µl Agencourt AMPure XP Beads (0.7×),用移液器吹打混匀;
    5)
    室温下孵育5 min;置于磁力架上待溶液澄清后,将上清液转移至新的离心管中;
    6)
    加入50 µl Agencourt AMPure XP Beads (0.2×) 至上一步所得上清液中,用移液器吹打混匀;
    7)
    室温下孵育5 min,置于磁力架上待溶液澄清后,弃去上清液;
    8)
    加入700 µl新鲜配制的70% Ethanol洗涤磁珠两次;
    9)
    室温晾干,使Ethanol充分蒸发;
    10)
    加入30 µl TE Buffer溶解DNA。
  18. Hi-C文库质控 (Quality Control of Hi-C Library)
    1)
    使用QubitTM dsDNA HS Assay Kit对文库的浓度进行初步定量 (https://www.thermofisher.cn/order/catalog/product/Q32851?SID=srch-hj-Q32851#/Q32851?SID=srch-hj-Q32851)。
    2)
    使用Agilent High Sensitivity DNA Kit检测文库DNA片段的完整性及插入片段的大小 (https://www.agilent.com.cn/cs/library/usermanuals/public/HighSensitivity_DNA_KG.pdf.pdf)。
    当文库浓度>5 µg/µl,体积>20 µl;文库片段大小集中在500-600 bp 即可将文库送测序公司进行上机测序。
    3)
    qPCR法对文库的有效浓度进行精确定量 (测序公司对文库进行qPCR质控)。
  19. Hi-C文库测序 (Hi-C Sequencing)
    所获得的Hi-C文库使用Illumina HiseqXten (PE150) 平台进行上机测序,测序深度根据物种的基因组大小和项目的设计进行确定。在蝴蝶基因组研究中数据量通常按物种基因组大小的100× 进行测序。

致谢

感谢国家自然科学基金委员会创新研究群体 (31621062)、国家自然科学基金委员会面上项目 (32070482)、中国科学院西部之光项目 (A类) 对中国科学院昆明动物研究所遗传资源与进化国家重点实验室的支持。

参考文献

  1. Belton, J. M., McCord, R. P., Gibcus, J. H., Naumova, N., Zhan, Y. and Dekker, J. (2012). Hi-C: a comprehensive technique to capture the conformation of genomes. Methods 58 (3): 268–276.
  2. Dekker, J., Rippe, K., Dekker, M. and Kleckner, N. (2002). Capturing chromosome conformation. Science 295 (5558): 1306–1311.
  3. Lieberman-Aiden, E., van Berkum, N.L., Williams, L., Imakaev, M., Ragoczy, T., Telling, A., Amit, I., et al. (2009). Comprehensive mapping of long-range interactions reveals folding principles of the human genome. Science 326: 289–293.
  4. Lu, S., Yang, J., Dai, X., Xie, F., He, J., Dong, Z., Mao, J., Liu, G., Chang, Z., Zhao, R., Wan, W., Zhang, R., Li, J., Wang, W. and Li, X. (2019). Chromosomal-level reference genome of Chinese peacock butterfly (Papilio bianor) based on third-generation DNA sequencing and Hi-C analysis. GigaScience 8: 128.
  5. Ma, W., Ay, F., Lee, C., Gulsoy, G., Deng, X., Cook, S., Hesson, J., Cavanaugh, C., Ware, C.B., Krumm, A., Shendure, J., Blau, C. A., Disteche, C. M., Noble, W. S. and Duan, Z. (2015). Fine-scale chromatin interaction maps reveal the cis-regulatory landscape of human lincRNA genes. Nat Methods 12: 71–78.
  6. Nagano, T., Lubling, Y., Yaffe, E., Wingett, S.W., Dean, W., Tanay, A. and Fraser, P. (2015). Single-cell Hi-C for genome-wide detection of chromatin interactions that occur simultaneously in a single cell. Nat Protoc 10: 1986–2003.
  7. van Berkum, N.L., Lieberman-Aiden, E., Williams, L., Imakaev, M., Gnirke, A., Mirny, L.A., Dekker, J. and Lander, E.S. (2010). Hi-C: a method to study the three-dimensional architecture of genomes. J Vis Exp (39): 1869.
  8. Yang, J., Wan, W., Xie, M., Mao, J., Dong, Z., Lu, S., He, J., Xie, F., Liu, G., Dai, X., Chang, Z., Zhao, R., Zhang, R., Wang, S., Zhang, Y., Zhang, W., Wang, W. and Li, X. (2020). Chromosome-level reference genome assembly and gene editing of the dead-leaf butterfly Kallima inachus. Mol Ecol Resour 20(4): 1080–1092.
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Copyright: © 2021 The Authors; exclusive licensee Bio-protocol LLC.
引用格式:万雯婷, 常洲, 董志巍, 王文, 李学燕. (2021). 蝴蝶Hi-C文库构建. Bio-101: e1010654. DOI: 10.21769/BioProtoc.1010654.
How to cite: Wan, W.T., Chang, Z., Dong, Z.W., Wang, W. and Li, X.Y. (2021). Construction of Hi-C Library for Butterfly. Bio-101: e1010654. DOI: 10.21769/BioProtoc.1010654.
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