AFLP Genome Capture Technique: A General Method for Shallow Scale Phylogenetic Analysis   

材料与试剂

1. 0.2 ml和1.5 ml微量离心管 (BBI Life Sciences，常温储存)
2. 200 μl八联排管 (BBI Life Sciences，常温储存)
3. 各种型号的枪头 (10 μl，200 μl，1 ml，BBI Life Sciences，常温储存)
4. 基因组DNA提取试剂盒 (北京天根生化科技有限公司，常温储存，catalog number: DP304-03)
5. 无水乙醇 (分析纯) (广州化学试剂厂，常温储存)
6. AMPure XP beads (Beckman Coulter，4 °C储存，catalog number: A63881)
7. Dynabeads MyOne Streptavidin C1 (Life Technologies，4 °C储存，catalog number: 65001)
8. FastDigest MluI (Thermo Fisher Scientific，-20 °C储存，catalog number: FD0564)
9. FastDigest SbfI (Thermo Fisher Scientific，-20 °C储存，catalog number: FD1194)
10. T4 DNA ligase (5 U/μl) (Thermo Fisher Scientific，-20 °C储存，catalog number: EL0014)
11. Human Cot-1 DNA (1 µg/µl) (Thermo Fisher Scientific，-20 °C储存，catalog number: 15279011)
12. NEBNext Ultra DNA Library Prep Kit for Illumina (New England Biolabs，-20 °C储存，catalog number: E7645L)
13. NEBNext dsDNA Fragmentase (New England Biolabs，-20 °C储存，catalog number: M0348L)
14. TransTaq DNA Polymerase High Fidelity (HiFi) (北京全式金生物技术有限公司，-20 °C储存，catalog number: AP131-03)
15. 100 mM ATP (上海生工生物工程股份有限公司，-20 °C储存，catalog number: A600311)
16. 10 mM dNTPs (上海生工，-20 °C储存，catalog number: A610056)
17. 1X TE buffer (上海生工，4 °C储存，catalog number: B548106)
18. 20X SSPE buffer (上海生工，4 °C储存，catalog number: B548111)
19. 50X Denhardt’s Solution (上海生工，-20 °C储存，catalog number: B548209)
20. 10 % SDS Solution (上海生工，常温储存，catalog number: B548118)
21. 20X SSC buffer (上海生工，4 °C储存，catalog number: B548109)
22. 5 M NaCl (上海生工，4 °C储存，catalog number: B548121)
23. 1 M Tris-HCl Solution，pH 8.0 (上海生工，4 °C储存，catalog number: B548127)
24. 0.5 M EDTA，pH8.0 (上海生工，4 °C储存，catalog number: B300599)
25. 吐温20 (上海生工，常温储存，catalog number: A600560)
26. 矿物油 (上海生工，常温储存，catalog number: A630217)
27. 琼脂糖 (Invitrogen，常温储存，catalog number: 75510-019)
28. 双蒸水 (广州誉维生物科技仪器有限公司Unique超纯水机制)
29. 吸附缓冲液 (见配方，4 °C储存)
30. 洗涤缓冲液1 (见配方，4 °C储存)
31. 洗涤缓冲液2 (见配方，4 °C储存)
    

仪器设备

1. 0.5-5 μl，2-20 μl，20-200 μl，100-1000μl移液器 (Thermo Fisher Scientific F2系列)
2. Gene Pro PCR扩增仪 (杭州博日科技股份技术有限公司，model: TC-E-96G)
3. Vortex Genie2漩涡混合器 (Scientific Industries，model: G560E)
4. Cubee迷你离心机 (广州美津生物技术有限公司，model: aqbd-i)
5. 振荡型恒温金属浴 (杭州奥盛仪器有限公司，model: MS-100)
6. DynaMag-2 Magnet磁力架 (Thermo Fisher Scientific，model: 12321D)
7. 超微量分光光度仪 (Thermo Fisher Scientific，model: NanoDrop2000)
8. 通用电泳仪 (北京百晶生物技术有限公司，model: BC-power6001)
9. 高压蒸汽灭菌锅 (Kagoshima Seisakusyo Inc.，model: SX-500)
10. 服务器 (Linux系统，32 G以上的内存，500 G的存储)
    

软件

1. Seqtk_demultiplex https://github.com/jameslz/fastx-utils/blob/master/seqtk_demultiplex/
2. SPAdes https://github.com/ablab/spades/
3. CD-HIT https://github.com/weizhongli/cdhit/
4. BLAST 2.6.0 ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/blast/executables/blast+/2.6.0/
5. Python 2.7.9 https://www.python.org/ftp/python/2.7.9/
6. Biopython 1.68 https://pypi.org/project/biopython/1.68/
7. PASTA https://github.com/smirarab/pasta
8. FastTree http://www.microbesonline.org/fasttree/#Install
9. Phylopypruner https://gitlab.com/fethalen/phylopypruner/-/wikis/Installation
10. RAxML https://github.com/stamatak/standard-RAxML
11. ASTRAL 5.7.4 https://github.com/smirarab/ASTRAL
    

实验步骤

AFLP基因组捕获技术的实验流程,可分为三个步骤: AFLP探针制备，基因组文库构建以及杂交捕获，其工作流程如图1所示。


图1. AFLP基因组捕获技术的工作流程图

一、 AFLP探针制备 (总耗时: 约7 h)
读者需要挑选一个与研究类群相关的探针制备物种，并将它的基因组DNA作为起始模板，按照以下四个步骤完成AFLP探针的制备 (见图1)：(1) 限制性内切酶消化；(2) 接头连接和片段筛选；(3) 预扩增；(4) 选择性扩增。其中，限制性内切酶消化和选择性扩增是影响AFLP探针制备结果的关键步骤，因为它们决定了AFLP探针的长度范围和数量等。需要指出的是，探针制备物种的基因组DNA质量对AFLP探针制备的实验结果至关重要。在利用限制性内切酶消化基因组DNA的过程中，如果基因组DNA的质量较差 (如DNA无主带或DNA有主带，但同时存在明显的弥散条带)，大量的限制性酶切识别位点会因DNA降解而丢失，这将导致酶切片段总数量的减少，从而导致AFLP探针数量的减少。因此，建议读者优先挑选基因组DNA质量较好的样本作为探针制备物种，选择标准为：在基因组DNA的电泳检测结果中，基因组DNA条带的长度大于20 Kb，且无明显的弥散条带。

1. 限制性内切酶消化 (耗时：约1 h)
   1.1

   取1 μg 高分子量的基因组DNA (>10Kb) 于新的0.2 ml离心管中。
   1.2

   按下表建立酶切反应体系 (表1)。
   
   表1. 酶切反应体系
   
   
   
   1.3

   将配制好的酶切反应体系充分涡旋混匀，简短离心，37 °C孵育20 min。
   1.4

   将上一步溶液转移至新的1.5 ml离心管中，使用AMPure XP磁珠纯化酶切产物。
   注：纯化开始前将AMPure XP磁珠平衡至室温，然后涡旋5-10 min，使其充分悬浮。
   1.5

   向20 μl酶切反应液中加入36 μl (体积比1:1.8) AMPure XP磁珠，用移液器吸打混匀至少10次，室温孵育5 min。
   1.6

   将含磁珠的离心管置于磁力架上，室温孵育5 min，待溶液变澄清。
   1.7

   小心地移除上清液，注意动作要轻柔，不要扰动磁珠。
   1.8

   保持离心管置于磁力架上，向离心管底部轻柔地加入200 μl 80 %新鲜配制的乙醇溶液 (注意不要扰动磁珠)，室温孵育30 s，小心地移除上清液。
   1.9

   重复操作步骤1.8。
   1.10

   使用量程 < 20 μl的移液器移除管底残留的乙醇，注意不要扰动磁珠。
   1.11

   将离心管开盖置于磁力架上，室温孵育5 min，自然晾干。
   1.12

   将离心管从磁力架上取下，向离心管中加入52 μl 0.1X TE缓冲液，并使用移液器吸打混匀，使磁珠充分悬浮，室温孵育2 min。
   1.13

   将离心管置于磁力架上，室温孵育5 min，待溶液变澄清。
   1.14

   小心地吸取上清液 (酶切纯化产物) 至新的0.2 ml离心管中。
   1.15

   取1 μl 酶切纯化产物，使用1.2 %的琼脂糖凝胶电泳进行检测。
   注：在酶切纯化产物的电泳检测结果中，如果酶切后的基因组DNA与酶切反应前的基因组DNA相比，无主带，且呈现出明显的弥散条带，则证明酶切实验成功。
   1.16

   立刻进行下一步操作或将产物保存于-20 °C (建议保存时间不超过7 d)。
2. 接头连接和片段筛选 (耗时：约1.5 h)
   2.1

   在新的0.2 ml离心管中，按下表建立接头连接反应体系 (表2)。
   
   表2. 接头连接反应体系
   
   
   
   2.2

   将配制好的接头连接反应体系充分涡旋混匀，并简短离心，45 °C孵育5 min。
   2.3

   迅速将含有连接反应液的离心管置于冰上，向离心管中加入1 μl T4 DNA ligase (5U/μl)，充分涡旋混匀，并简短离心，25 °C孵育30 min。
   2.4

   将60 μl连接产物转移至新的1.5 ml离心管中，使用AMPure XP磁珠进行片段筛选。
   注：片段筛选开始前需要涡旋AMPure XP磁珠，使其充分悬浮。
   2.5

   向离心管中加入15 μl AMPure XP磁珠，用移液器吸打混匀至少10次，室温孵育5 min。
   2.6

   将含磁珠的离心管置于磁力架上，室温孵育5 min，待溶液变澄清。
   2.7

   小心地吸取上清液至新的1.5 ml离心管中，注意动作要轻柔，不要吸到磁珠。
   注: 保留上清液，丢弃磁珠，目的是去除大片段DNA (> 5 Kb)。
   2.8

   向离心管中加入20 μl AMPure XP磁珠，用移液器吸打混匀至少10次，室温孵育5 min。
   2.9

   将含磁珠的离心管置于磁力架上，室温孵育5 min，待溶液变澄清。
   2.10

   小心地移除上清液，注意动作要轻柔，不要扰动磁珠。
   注：保留磁珠，丢弃上清液，目的是去除小片段DNA (< 200 bp)，并确保连接产物的长度范围在200-5000 bp之间。
   2.11

   保持离心管置于磁力架上，向离心管底部轻柔地加入200 μl 80 %新鲜配制的乙醇溶液 (注意不要扰动磁珠)，室温孵育30 s，小心地移除上清液。
   2.12

   重复操作步骤2.11。
   2.13

   将离心管开盖置于磁力架上，室温孵育5 min，自然晾干。
   2.14

   将离心管从磁力架上取下，向离心管中加入30 μl 0.1X TE缓冲液，并使用移液器吸打混匀，使磁珠充分悬浮，室温孵育2 min。
   2.15

   将离心管置于磁力架上，室温孵育5 min，待溶液变澄清。
   2.16

   小心地吸取上清液 (片段筛选产物) 至新的0.2 ml离心管中。通过NanoDrop2000分光光度计测量浓度，并使用0.1X TE缓冲液稀释片段筛选产物，使其终浓度达到1 ng/μl。
   2.17

   建议立刻进行下一步的操作，剩余产物可保存于-20 °C (建议保存时间不超过1年)。
3. 预扩增 (耗时：约2 h)
   3.1

   在新的0.2 ml离心管中，按下表建立预扩增反应体系 (表3)。
   
   表3. 预扩增反应体系
   
   注：MluI-F和SbfI-R的序列见附录。
   
   
   3.2

   将配制好的预扩增反应体系充分涡旋混匀，并简短离心，随后将离心管放入PCR仪中进行预扩增，反应程序见下表 (表4)。
   
   表4.预扩增反应程序
   
   
   
   3.3

   取2 μl预扩增产物，使用1 %的琼脂糖凝胶电泳进行检测。
   注：在预扩增产物的电泳检测结果中，如果在200-5000 bp的范围内出现弥散条带，则证明预扩增实验成功。
   3.4

   向离心管中加入10倍体积的0.1X TE缓冲液，以作下一步选择性扩增的模板。
   3.5

   建议立刻进行下一步操作，剩余产物保存于-20 °C (建议保存时间不超过1年)
4. 选择性扩增 (耗时：约2.5 h)
   本方法提供了两条上游的选择性扩增引物和两条下游的选择性扩增引物，共四对组合 (引物序列见附录，组合见表5)。每一条引物的3’ 末端都添加了单个选择性核苷酸 (见图1的AFLP探针制备)，目的是为了控制AFLP片段数目。例如，使用表5中任意一对引物组合进行选择性扩增，理论上能够获得已回收酶切片段数目的1/16 (1/4 × 1/4)。此外，两条下游的选择性扩增引物的5’ 末端都添加了生物素标记 (biotin)，目的是通过PCR扩增的方法，将生物素标记添加到AFLP片段中，以获得可直接用于杂交捕获实验的AFLP探针 (见图1的AFLP探针制备)。考虑到每对引物组合扩增出的AFLP探针不同，读者可以根据自身对目标基因数目的需求量仅使用其中某一组探针，或者将不同组的探针混合在一起使用。根据本方法在臭蛙属 (隶属于两栖纲，蛙科) 中的测试结果 (Li et al., 2019)，当混合使用四组AFLP探针 (表5) 进行序列捕获时，最终能够在属内种间水平上得到511个直系同源序列组 (orthologous groups，OGs)。这511个OGs的长度分布范围为203-7779 bp，与AFLP探针的长度范围相近 (200-5000 bp)。其中有一些OG的长度大于5000 bp，这证明了该方法不仅可以捕获目标区域，还可以捕获目标区域两侧的侧翼序列 (flanking sequence)，获得这些额外的侧翼序列可能会增强系统发育分析的信号。本方法提供的引物具有通用性，适用于不同的生物类群。若读者需要更多的选择性扩增引物，可参考上述设计思路自行设计。值得一提的是，选择性核苷酸的数目与研究对象的基因组大小有关，若基因组小于5 Gb，建议在上游和下游引物中添加单个选择性核苷酸 (与本方法提供的引物设计思路一致)，若基因组大于5 Gb，建议在上游或下游引物中添加两个及两个以上的选择性核苷酸。
   
   表5. 选择性扩增引物组合信息表
   
   
   
   4.1

   在新的0.2 ml离心管中，按下表建立选择性扩增反应体系 (表6)。
   

   
   表6. 选择性扩增反应体系
   
   
   

   4.2

   将配制好的选择性扩增反应体系充分涡旋混匀，并简短离心，随后将离心管放入PCR仪中进行选择性扩增，反应程序见上表 (表7)。
   
   表7. 选择性扩增反应程序
   
   

   
   4.3 反应结束后，将不同组的选择性扩增产物分别转移至新的1.5 ml离心管中。

   4.4 使用AMPure XP磁珠纯化选择性扩增产物，最后使用20 μl 0.1X TE 缓冲液进行洗脱。

   4.5 取1 μl 纯化的选择性扩增产物 (AFLP探针)，使用1 %的琼脂糖凝胶电泳进行检测。如图2所示，每一对引物组合都能扩增出长度不同的AFLP片段，同时，不同引物组合间呈现出的AFLP带型规律也各不相同，则证明了AFLP探针制备实验成功。

   
   
   
   图2. AFLP探针的电泳结果示意图。 泳道1-4代表了四对选择性引物组合的扩增结果。
   
   

   4.6

   通过NanoDrop2000分光光度计测量浓度，并向离心管中加入0.1X TE缓冲液稀释AFLP探针，使其最终浓度达到50 ng/μl，以便用于后续的杂交捕获实验。剩余的探针溶液可保存于-20 °C (建议保存时间不超过1年)

二、 基因组文库构建 (总耗时：约5 h)
本方法对高通量测序平台的测序读长没有严格要求，所以它适用于所有的二代测序平台，如Illumina，Ion Torrent，BGISEQ等。读者可根据自身对测序平台的熟悉程度，购买与测序平台相匹配的基因组文库构建试剂盒进行文库构建。本方法以NEBNext Ultra DNA Library Prep Kit for Illumina试剂盒为例，简要地介绍了Illumina基因组文库构建的方法。为了保证基因组文库具有较高的质量和良好的多样性，建议尽量选择DNA质量好 (> 4 Kb) 的样本用于文库构建，DNA初始投入量在200 ng-1 μg，1 μg最优。

1. DNA片段化 (耗时：约1 h)
   该步骤的目的是为了获得符合Illumina测序平台的要求的，具有一定长度范围的DNA片段。以HiSeq X ten测序平台为例，该平台期望的插入DNA片段大小在200-400 bp之间，所以片段化后的DNA片段最好集中在这个区域。片段化的方法有超声处理，酶处理等，对于新手而言，推荐使用后者，因为该过程不依赖特殊仪器 (超声波DNA打断仪)，且入手简单。本方法以NEBNext DNA双链片段化酶为例，介绍了DNA片段化的方法，具体操作步骤和注意事项可参阅产品说明书：
   https://international.neb.com/protocols/0001/01/01/digestion-with-nebnext-dsdna-fragmentase-m0348
   1.1

   取1 μg基因组DNA于新的0.2 ml离心管中。
   1.2

   按下表建立片段化反应体系 (表8)。
   
   表8. 片段化反应体系
   
   注：片段化体系的准备工作在冰上完成。
   
   
   1.3

   将配制好的片段化反应体系充分涡旋混匀，并简短离心， 37 °C孵育10-25 min。
   注: 建议读者做时间梯度预实验 (如: 10 min，12min，14 min) 来确定最优的片段化时间。判断标准是：在片段化产物的电泳检测结果中，与片段化反应前的基因组DNA相比，片段化后的DNA片段主要集中在200-400 bp的范围内。
   1.4

   迅速将离心管转移至冰上，随后向离心管中加入2 μl 0.5 M EDTA，充分涡旋混匀，并简短离心，65 °C孵育15 min，使片段化酶彻底失活。
   1.5

   取2 μl片段化产物，使用2 %的琼脂糖凝胶电泳进行检测。在片段化的电泳检测结果中，如果片段化后的产物存在主带或片段大小不在期望的范围内 (200-400 bp)，则需要调整片段化时间，重新进行实验。
   1.6

   使用AMPure XP磁珠纯化片段化产物，最后使用20 ul灭菌双蒸水进行洗脱。
2. 补平加A和接头连接 (耗时：约2.5 h)
   这些步骤的主要目的是为了在DNA片段的两端添加Illumina测序接头。此外，为了区分不同的样本，测序接头上还应包含样本特异性标签 (barcode或index)。具体操作步骤请参阅文库构建试剂盒说明书
   https://international.neb.com/protocols/2015/01/14/protocol-for-use-with-nebnext-ffpe-dna-repair-mix-m6630-and-ultra-dna-library-prep-kit-for-illumina-e7370
3. 片段筛选及PCR扩增 (耗时：约1.5 h)
   3.1

   片段筛选
   该步骤的目的是为了特异性地回收300-500 bp的DNA片段 (包括测序接头的长度)，去除过大或过小的双链或单链DNA片段。实验操作与AFLP探针制备过程中的片段筛选步骤一致，但磁珠用量不同，对于回收300-500 bp范围内的DNA片段，可参阅试剂盒说明书。
   3.2

   PCR扩增
   PCR扩增循环数与DNA初始投入量相关。为了防止过度地扩增基因组文库，使其保持良好的多样性，当DNA初始投入量为1 μg，并采用片段化酶处理的方法构建基因组文库时，推荐使用6-8个PCR循环。

三、 杂交捕获 (总耗时：约41 h)
在系统发育研究中，捕获样本往往与探针制备样本不同。为了从捕获样本的基因组文库中杂交捕获到与探针同源的基因组区域，特别是从亲缘关系较远的样本中，通常需要根据捕获样本与探针制备样本之间的序列相似度，对杂交体系中的盐离子浓度，杂交反应温度等条件进行优化和调整。在本实验方法中，杂交反应体系中盐离子的终浓度为5X，且杂交反应的温度呈梯度下降 (Touch-down)，即杂交温度从65 °C起始，每隔一段时间下降3°C，最终下降至50°C。在此条件下，与探针的核酸序列相似度在65 %以上的单链DNA文库将被捕获。这种反应条件适合于大多数的系统发育研究。

1. 杂交 (耗时：约37 h)
   杂交反应体系共50 μl，其中包括18.5 μl的杂交缓冲液体系和31.5 μl的探针文库混合体系，在杂交反应开始前，两个子体系需要进行不同的预处理 (具体操作见下文)。为了降低实验成本，提高实验效率，本方法建议使用混合文库进行杂交实验。在准备混合文库时，读者首先需要根据样本间亲缘关系的远近, 基因组文库的质量 (指浓度和片段范围) 和文库特异性标签对捕获样本进行分组，将亲缘关系相近，基因组文库质量相近且不具有相同特异性标签的样本分为一组，每组的样本数量为2-7个，4个最优 (Portik et al. 2016)。随后将同一组的基因组文库等质量混合，以用于后续的杂交实验。
   1.1

   在新的0.2 ml离心管中，按下表建立杂交缓冲液体系 (表9)。
   
   表9. 杂交缓冲液体系
   
   注：20X SSPE在使用前需要充分涡旋混匀，10 % SDS需先置于室温充分溶解。
   
   
   1.2

   将杂交缓冲液体系充分涡旋混匀，并简短离心。然后向杂交缓冲液体系中加入12 μl矿物油 (确保封盖反应液表面)，并将离心管放入PCR仪中，65 °C孵育待用。
   1.3

   在新的0.2 ml离心管中，按下表建立探针文库混合体系 (表10)。
   
   表10. 探针文库混合体系
   
   注：(a) Human Cot-1 DNA是人的胎盘DNA，长度主要为50-300 bp，并且富含重复的DNA序列，在杂交反应中的作用是阻断非特异性杂交。(b) 寡核苷酸阻碍物BO1-5 (序列见附录) 的作用是防止DNA文库的接头发生交联，避免非特异性杂交。
   

   
   
   1.4

   将探针文库混合体系充分涡旋混匀，简短离心，然后向探针文库混合体系中加入15 μl矿物油 (确保封盖反应液表面)，并将离心管放入PCR仪中，95 °C孵育5 min。
   1.5

   使用量程50-200 μl的移液器，迅速将探针文库混合体系 (包括矿物油) 转移至65°C预热的杂交缓冲液体系中，吸打混匀5-10次，迅速盖紧离心管管盖进行杂交。杂交反应程序为: 65 °C 6 h，62 °C 6 h，59 °C 6 h，56 °C 6 h，53 °C 6 h，50 °C 6 h。
   注：杂交开始后，每6-12 h检查离心管是否渗漏。
   1.6

   杂交反应结束后，杂交产物可继续50 °C孵育数小时，直至准备好下一步所需的链霉亲和素磁珠。
2. 链霉亲和素磁珠吸附 (耗时：约1 h)
   链霉亲和素磁珠的用量与探针投入量存在对应关系，磁珠用量过多会造成浪费，过少可能会影响吸附效果。以Dynabeads Myone streptavidin C1磁珠为例，1 μl (50 μg) 磁珠可以吸附约200 ng的DNA片段。根据该对应关系，当杂交反应的AFLP探针投入量为200 ng时，建议使用3ul磁珠进行吸附。增加磁珠用量的原因是在吸附反应开始前，本实验方法会对链霉亲和素磁珠进行洗涤，部分磁力较弱的珠子将被丢弃，这有助于提高捕获的效率。
   2.1

   取n x 3 μl (n = 杂交反应数目，n不大于20) 链霉亲和素磁珠于新的1.5 ml 离心管中。
   注：链霉亲和素磁珠在使用前需要涡旋3-5 min，使其充分悬浮。
   2.2

   将含磁珠的离心管置于磁力架上，室温孵育2 min，待溶液变澄清。然后小心地移除上清液，注意不要扰动磁珠。
   2.3

   将离心管从磁力架上取下，向离心管中加入200 μl 吸附缓冲液 (2 M NaCl，10 mM Tris-HCl，pH 8.0，1 mM EDTA，pH 8.0)，涡旋5-10 s后，将离心管置于磁力架上，室温孵育2 min，待溶液变澄清。然后小心地移除上清液，注意不要扰动磁珠。
   2.4

   重复操作步骤2.3 两次。
   2.5

   将离心管从磁力架上取下，向离心管中加入 n x 20 μl 吸附缓冲液和n x 0.1 μl 10 % 吐温20，充分涡旋混匀，使磁珠悬浮。
   2.6

   取n个新的1.5 ml 离心管，并向管中加入180 μl 吸附缓冲液和20 μl 上一步重悬的磁珠，充分涡旋混匀，50 °C (最终的杂交温度) 孵育2 min。
   2.7

   小心地吸取杂交产物 (不包括矿物油) 至50 °C预热的含有磁珠的吸附缓冲液中。然后将离心管置于振荡型恒温金属浴中，在50 °C，1500 × g的条件下，孵育30 min。
3. 洗涤 (耗时：约1.5 h)
   该步骤的主要目的是利用不同盐离子浓度的缓冲液对杂交产物进行洗涤，以去除非目标捕获 (non-target) 和非特异性杂交的单链DNA文库，从而提高杂交捕获的效率。在本实验方法中，洗涤条件先宽松后严格，首先使用高离子浓度的洗涤缓冲液1 (1X SSC，0.1 % SDS) 对杂交产物进行洗涤，以去除非目标捕获的单链DNA文库，然后使用 50 °C (最终杂交温度) 预热的低离子浓度的洗涤缓冲液2 (0.1X SSC，0.1 % SDS) 对杂交产物进行洗涤，以去除非特异性杂交的单链DNA文库。
   3.1

   吸附反应结束后，将离心管从振荡型恒温金属浴中取下，并简短离心。然后将离心管置于磁力架上，室温孵育2 min，待溶液变澄清，彻底地移除上清液，注意不要扰动磁珠。
   注：该步骤结束后，50 °C孵育洗涤缓冲液2。
   3.2

   将离心管从磁力架上取下，向离心管中加入200 μl 洗涤缓冲液1，并使用移液器吸打混匀反应液，使磁珠充分悬浮 (动作要轻柔，以免产生大量气泡)，室温孵育10 min。然后将离心管置于磁力架上，室温孵育2 min，待溶液变澄清，彻底地移除上清液，注意不要扰动磁珠。
   3.3

   重复操作步骤3.2一次。
   3.4

   将离心管从磁力架上取下，向离心管中加入200 μl 50 °C 洗涤缓冲液2，并使用移液器吸打混匀反应液，使磁珠充分悬浮 (动作要轻柔，以免产生大量气泡)，50 °C孵育10 min。然后将离心管置于磁力架上，室温孵育2 min，待溶液变澄清，彻底地移除上清液，注意不要扰动磁珠。
   3.5

   重复操作步骤3.4两次。
   3.6

   将离心管从磁力架上取下，向离心管中加入30 μl 0.1X TE 缓冲液，并使用移液器吸打混匀，使磁珠充分悬浮。
   3.7

   建议立刻进行下一步操作，剩余的杂交产物可保存于-20 °C (建议保存时间不超过1年)。
4. PCR扩增及高通量测序 (耗时：约1.5 h)
   该步骤的目的是通过PCR扩增的方式将杂交捕获到的单链DNA文库变为双链DNA文库。对于探针和捕获文库的投入量分别为200 ng和500 ng的杂交反应，本方法推荐PCR扩增的模板投入量为3 μl，扩增循环数为10-12。PCR扩增反应体系的其余成分 (如引物和dNTPs等) 以及扩增反应程序，均与基因组文库制备流程中的PCR扩增步骤一致，详细信息可参阅试剂盒说明书。需要注意的是，在添加PCR扩增的模板时，务必保证带有磁珠的杂交产物溶液是充分悬浮的状态。
   4.1

   PCR扩增结束后，取1 μl扩增产物，使用2.0 %的琼脂糖凝胶电泳进行检测。
   4.2

   使用AMPure XP磁珠对扩增产物进行纯化，最后使用25 μl 0.1X TE缓冲液进行洗脱。
   4.3

   通过NanoDrop2000分光光度计测量纯化产物的浓度。然后将不同杂交反应的纯化的扩增产物等质量混合，并在2 %的琼脂糖凝胶中割胶回收300-500 bp范围内的DNA片段。
   注：混合扩增产物时需要保证样本间的特异性标签是不重复的。
   4.4

   将胶回收产物送往公司进行Illumina高通量测序。
   
   

结果与分析

AFLP基因组捕获技术可以产生匿名基因序列数据和SNP数据。其中，匿名基因序列数据可以用于属内种间水平上的系统发育分析，而SNP数据可以用于种群水平上的系统地理学分析。读者需要根据自身的研究需求进行数据的提取。目前，SNP数据提取与分析的流程已在现有文献中被详细描述 (McKenna et al. 2010; Depristo et al. 2011; Van der Auwera et al. 2013)，读者可参考上述文献对SNP数据进行提取与分析。本文将重点介绍从AFLP捕获数据中获取匿名基因序列数据的生物信息学分析流程，其主要流程可概括为: 数据分选与组装，直系同源序列的鉴定与提取，序列比对，数据质量控制以及系统发育分析。
一、 数据分选与组装

1. 使用Trimmomatic (v 0.39) 对测序得到的原始数据 (raw data) 进行质量控制和筛选，去除reads中的测序接头序列，去除平均碱基质量值低于20的reads，去除reads首端和末端碱基质量小于3或N的碱基，得到高质量的测序数据 (clean reads)。
   以处理双端测序数据为例:
   $ java -jar trimmomatic-0.39.jar PE RawReads_R1.fq.gz RawReads _R2.fq.gz RawReads_R1_paired.fq.gz RawReads_R1_unpaired.fq.gz RawReads_R2_paired.fq.gz RawReads_R2_unpaired.fq.gz ILLUMI-NACLIP:TruSeq3-PE.fa:2:30:10:2:keepBothReads LEADING:3 AVGQUAL:20 TRAILING:3 MINLEN:36
2. 依据各个样本的特异性标签 (barcode)，使用fastq-multx将clean reads分选到对应的实验样本中。
   以分选双端测序数据为例:
   $ fastq-multx -B barcode.txt -b CleanReads_R1_paired.fq.gz Clean-Reads_R2_paired.fq.gz -o %_R1_clean.fq %_R2_clean.fq
   注：“-B”用于提供特异性标签文件，%指的是输出文件名与barcode文件中的样本名称相对应。详细使用方法可参阅https://github.com/brwnj/fastq-multx.
3. 使用基因组拼接软件SPAdes对每个样本的clean data进行从头组装 (de novo assembly)。
   以组装样本A的clean reads为例:
   $ python spades.py –t 4 –m 20 -1 taxaA_R1_clean.fq -2 taxaA _R2_clean.fq –o taxaA_outdir
   注：“-t”用于设定线程数，“-m”用于设定内存大小 (Gb)，“-o”用于指定输出文件夹的路径和名称。
4. 使用cd-hit-est软件去除contigs中的冗余序列。
   以处理样本A的contigs为例:
   $cd-hit-est –i taxaA_contig.fasta –o taxaA_contig095.fasta –c 0.95 –n 10 –M 16000 –T 4
   注：“-c”用于设定冗余序列相似度阈值，“-M”用于设定内存大小 (Mb)，“-T”用于设定线程数。

二、 直系同源序列的鉴定与提取
使用同一套AFLP探针从不同样本的基因组文库中进行序列捕获时，不同样本间被捕获到的序列具有同源性。所以，本方法直接采取双向BLASTN策略从所有样本的contigs中鉴定直系同源序列组 (orthologous groups，OGs) (如图3中的步骤一)。做法是：首先从所有样本拼接的contigs中选择拼接总长度最长的contigs作为参考序列，然后将其他样本的contigs分别与参考序列进行双向BLASTN。若1号样本的A序列在参考序列的第一个BLAST Hit是B序列，反过来参考序列的B序列在1号样本中的第一个BLAST Hit 还是A序列，则A序列与B序列为1号样本与参考序列的直系同源序列。考虑到在一个OG中，样本间contigs的长度有所差异，这使它们很难进行序列比对。为了解决这个问题，本方法提出了一种修剪OG的策略，即在原始OG中寻找一个最佳区域，以降低比对的难度 (如图3中的步骤二)。上述所有过程可通过本实验室开发的“SearchOGs.py”脚本实现 (下载地址:https://figshare.com/s/5a4eee383e2dc9afba5)。
$ python SearchOG.py -c ./contigDir -r ./contigDir/reference.fasta -e 1E-10 -L 200 -S 0.7 -B 2 -C 0.5 -N 2 -o outdir
注：“-c”用于提供包含所有样本contigs文件在内的文件夹路径，“-r”用于提供参考序列文件的路径，“-e”用于设置BLAST比对的E-value阈值, “-L”用于设置BLAST Hit长度阈值，“-S”用于设置BLAST Hit的序列相似度阈值，“-B”用于设置最佳比对区域中上下限包含样本数目的阈值，“-C”用于设置最佳比对区域中修剪后的contigs长度与参考序列长度比例的阈值，“-N”用于设置直系同源序列组中所包含样本数目的阈值，“-o”用于指定输出文件夹的路径和名称。运行环境要求和参数详解请参阅该脚本的说明文件。


图3. 鉴定直系同源序列组的流程图

三、 序列比对
常用的多序列比对的软件有Muscle (http://www.drive5.com/muscle)，MAFFT (https://mafft.cbrc.jp/alignment/software/)，Bali-Phy (http://www.bali-phy.org/)，SATé (http://phylo.bio.ku.edu/software/sate/)，PASTA (https://github.com/smirarab/pasta)等。考虑到大多数被AFLP探针捕获的匿名基因组序列都是快速进化的非编码序列，因此，为了提高序列比对的准确性，推荐使用针对高变序列比对专门设计的程序如SATé和PASTA。
例如，使用PASTA处理一个OG文件:
$ python run_pasta.py –i OG1.fasta
注：PASTA具体使用方法请参阅 https://github.com/smirarab/pasta/blob/master/pasta-doc/pasta-tutorial.md#step-2-inspecting-the-output-of-pasta

四、 数据质量控制
为了进一步提高数据质量，确保所鉴定的直系同源基因数据集的准确性，本方法对每个alignment 构建单基因树。通过分析基因树中各分枝的长度和判断基因树的拓扑结构，将枝长异常的序列，旁系同源序列以及污染序列从数据集中剔除 (如图4)。以臭蛙属为例，本方法能够从11个臭蛙属物种和2个外类群物种中鉴定出511个OGs，共4142条序列，碱基缺失率为35.6% (包含外类群物种在内)。经过数据质量控制之后，有11条不合格的序列被剔除，碱基缺失率变为35.9%。虽然数据集的碱基缺失率有所增加，但剔除枝长异常的序列，旁系同源序列以及污染序列将大大提高最终数据集的可靠性。


图4. 基于单基因树构建的方法去除长枝，旁系同源序列以及污染序列的示意图 (Kapli et al. 2020)。

以处理一个OG为例:

1. 单基因树构建:
   $ FastTree –gtr –nt OG1_align.fasta > OG1_align.tree
2. 借助Phylopypruner去除长枝 (含有长枝的基因树拓扑结构可参照图3中的拓扑结构A)，例如，删除某一枝长大于树中所有分枝标准差3倍的序列:
   $ phylopypruner --trim-lb 3 OG1_align.fasta OG1_align.tree
   注：Phylopypruner具体使用方法请参阅 https://gitlab.com/fethalen/phylopypruner/-/wikis/methods#paralogy-pruning-
3. 去除旁系同源序列或污染序列，其标准是观察单基因树拓扑结构中是否存在聚类关系怪异的分支，可参照图4中基因树拓扑结构B和C同正确的基因树拓扑结构之间的差异。
4. 使用PASTA对数据质量控制后的alignment再次进行比对。
   $ python run_pasta.py –i OG1_realign.fasta
5. 使用Gblocks剔除比对模糊的区域。
   $ Gblock OG1_realign.fasta –b5=a
   注:Gblock软件的详细参数介绍可参阅http://molevol.cmima.csic.es/castresana/Gblocks/Gblocks_documentation.html

   
   

1. 串联树构建
   将所有的OG比对矩阵进行串联处理，生成一个大型的数据矩阵集，并使用RAxML构建ML树:
   $ raxmlHPC-PTHREADS-AVX –T 4 -f a -x 12347 -p 12845 -# 500 -m GTRGAMMA –s CombineOGs.fasta –n CombineOGs_MLtree_500boostrap
   注：“-f”用于选择RAxML运算的算法，a表示执行快速Bootstrap分析并搜索最佳得分的 ML树，“-x”用于指定一个随机数作为随机种子，以启动快速Bootstrap算法，“-#”用于提供Bootstrap的次数，“-m”用于指定核苷酸或氨基酸的替代模型。RAxML参数的详细使用说明请参阅https://cme.h-its.org/exelixis/resource/download/NewManual.pdf
2. 物种树构建
   2.1

   使用RAxML构建每一个OG的单基因树，以处理一个OG为例:
   $ raxmlHPC-PTHREADS-AVX –T 4 -f a -x 12347 -p 12845 -# 100 -m GTR-GAMMA –s OG1_realign.fasta –n OG1_MLtree_100boostrap
   2.2

   使用ASTRAL构建物种树:
   $ java -jar astral.5.7.4.jar -i OG_best_trees.tre -b OG_bs_files -o OG_astral_result
   注：ASTRAL参数的详细使用说明请参阅https://github.com/smirarab/ASTRAL/blob/master/astral-tutorial.md

溶液配方

1. 10X接头淬火缓冲液配方 (表11)
   
   表11. 10X接头淬火缓冲液体系
   
   
   
2. 10 μM MluI adapter制备方法
   在0.2 ml 离心管中，建立双链MluI接头淬火体系 (表12)。
   
   表12. 双链MluI接头淬火体系
   
   充分涡旋混匀，利用下述条件进行淬火反应，形成局部互补的DNA双链接头：95 °C 5 min；95 °C降到12 °C，每秒0.1 °C；保持在12 °C。反应结束后，将退火后的接头溶液放置于-20 °C保存
   
   
3. 10 μM SbfI adapter制备方法
   在0.2 ml 离心管中，建立双链SbfI接头淬火的体系 (表13)。
   
   表13. 双链SbfI接头淬火体系
   
   充分涡旋混匀，利用下述条件进行淬火反应，形成局部互补的DNA双链接头： 95 °C 5 min；95 °C降到12 °C，每秒0.1 °C；保持在12 °C。反应结束后，将退火后的接头溶液放置于-20 °C保存。
   
   
4. 吸附缓冲液配方 (表14)
   
   表14. 吸附缓冲液体系
   
   
   
5. 洗涤缓冲液1 (表15)
   
   表15. 洗涤缓冲液1体系
   
   
   
6. 洗涤缓冲液2 (表16)
   
   表16. 洗涤缓冲液2体系
   
   
   

附件

致谢

实验方案摘自发表的文章Jia-Xuan Li, Zhao-Chi Zeng, Ying-Yong Wang, Dan Liang, Peng Zhang*. (2019). Sequence capture using AFLP-generated baits: A cost effective method for high-throughput phylogenetic and phylogeographic analysis. Ecology and Evolution, 9(10), 5925-5937.

竞争性利益声明

作者声明没有利益冲突

参考文献

1. DePristo, M. A., Banks, E., Poplin, R., Garimella, K. V., Maguire, J. R., Hartl, C. and Daly, M. J. (2011). A framework for variation discovery and genotyping using next‐generation DNA sequencing data. Nature Genetics 43(5), 491–498. 
2. Li,C., Hofreiter, M., Straube, N., Corrigan, S. and Naylor, G. J. (2013). Capturing protein-coding genes across highly divergent species. BioTechniques 54(6), 321-326. 
3. Li, J., Zeng, Z., Wang, Y., Liang, D., Zhang, P. (2019). Sequence capture using AFLP-generated baits: A cost effective method for high-throughput phylogenetic and phylogeographic analysis. Ecology and Evolution 9(10): 5925-5937. 
4. Kapli, P., Yang, Z. H. and Telford, M. J. (2020). Phylogenetic tree building in the genomic age. Nature Review Genetics 21(7): 428-444.
5. McKenna, A., Hanna, M., Banks, E., Sivachenko, A., Cibulskis, K., Kernytsky, A. and DePristo, M. a. (2010). The genome analysis tool‐kit: A MapReduce framework for analyzing next‐generation DNA sequencing data. Genome Re-search 20(9), 1297–1303. 
6. Portik, D. M., Smith, L. L, Bi, K. (2016). An evaluation of transcriptome-based exon capture for frog phylogenomics across multiple scales of divergence (Class: Amphibia,Order: Anura). Molecular Ecology Resources 16(5):1069-83. 
7. Van der Auwera, G. A., Carneiro, M. O., Hartl, C., Poplin, R., del Angel, G., Levy‐Moonshine, A. and DePristo, M. A. (2013). From fastQ data to high‐confidence variant calls: The genome analysis toolkit best practices pipeline. Current Protocols in Bioinformatics 43, 11.10.1–11.10.33.