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表面等离子共振技术垂钓实验的操作方法Vendor   

利用Biacore T200系统,以bait蛋白为“诱饵”,在混合样品中垂钓与之结合的分子,并利用质谱对回收到的样品进行鉴定,从而发现与bait蛋白相互作用的分子。
关键词: 蛋白质,相互作用,SPR,Biacore

材料与试剂

  1. 无盖1.5 ml EP管(Cytiva,货号:BR-1002-87)
  2. 4.0 ml 玻璃瓶(Cytiva,货号:BR-1002-09)
  3. 橡胶瓶盖2型(Cytiva,货号: BR-1004-11)
  4. S系列CM5芯片(Cytiva,货号:29-1049-88(一片装),BR-1005-30(三片装),29-1496-03(十片装))
  5. 缓冲液:10x HBS-EP+ (Cytiva,货号:BR-1006-69)
  6. 去离子水(0.22 μm膜过滤)。
  7. Bait蛋白:如果为商业化蛋白粉末,用水稀释到200 μg/ml,分装在-20 °C保存。客户需要确定蛋白的活性,在进行溶解时,确保溶解液不含Tris等带有伯氨基团的成分。

仪器设备

  1. Biacore T200生物分子相互作用系统 (Cytiva,货号:28975001)

实验步骤

一、仪器准备

  1. 开机操作
    1.1
    打开Biacore T200系统和电脑的电源开关。Biacore T200的电源开关位于系统背面的左下角。开机后,需等待检测单元的温度达到预设温度(用户自设,通常为25 °C)。待温度稳定后,面板上的温度指示灯(黄色)会停止闪烁,该过程可能需要30-60分钟。
    1.2
    打开Biacore T200 控制软件(Start→Program→Biacore→Biacore T200 Control Software),运行后软件程序会自动和主机系统建立连接。
    1.3
    准备运行缓冲液。量取50 ml 10 x HBS-EP + buffer、450 ml 去离子水(已经0.22 μm膜过滤),混匀后放入500 ml 缓冲液瓶。
  2. 缓冲液的放置
    2.1
    将已配制好的缓冲液放在T200系统左侧的缓冲液托架上,换上黑色的单孔盖。
    2.2
    将缓冲液进液管A(注意软管上的蓝色标签)插入至缓冲液瓶底部。其余三根进液管(B、C和D)放在左侧的舱门后。
    2.3
    将2 L的废液瓶放置在T200系统右侧的缓冲液托架上,连接上专用的盖子。
    2.4
    取500 ml 去离子水装入500 ml 缓冲液瓶,放置在右侧缓冲液托架上用于清洗进样针。
  3. 芯片的放置
    3.1
    点击工具条中的按钮或选择Tools菜单中的Insert Chip选项,打开芯片舱门。
    3.2
    如果已经有芯片在芯片舱内,点击工具条中的按钮或选择Tools菜单中的Eject Chip选项。



    3.3
    如果使用的是新芯片,选择New Chip。在Chip Type的下拉菜单中选择对应的芯片种类(此实验为CM5芯片),在Chip Id中填入和芯片相关的实验信息,Chip lot No.中可填入芯片批号(选填)。如果是已经使用过的芯片,请选择Reuse Chip,并在Chip Id下拉菜单中找到与之相对应的芯片信息。



    3.4
    手持芯片,有字的一面朝上。按照芯片上的箭头方向,将芯片轻轻推入卡槽,最后合上芯片舱的舱门。



    3.5
    点击Dock Chip按钮,芯片置入后系统将自动转入待机(Standby)状态。
    3.6
    选择Tools→Prime命令,点击Start。缓冲液会以较高的流速冲洗整个内部的流路系统,整个过程耗时6-7分钟。结束后,点击Close,系统自动转入待机(Standby)状态。注意:当系统更换缓冲液或者芯片后,必须运行Prime程序。Prime时缓冲液会冲洗整个流路系统,为下一步的实验做好准备。
  4. 放置试管架
    4.1
    Biacore T200有三种不同的试管架供用户使用:Reagent Rack 1、Reagent Rack 2(图A)和Sample and Reagent Rack1(图B),见下图。


    图A:Reagent Rack 1&2(左1右2) 图B: Sample and Reagent Rack1

    垂钓实验中使用Sample and Reagent Rack1。
    4.2
    点击工具栏按钮,或选择Tool→Eject Rack,样品舱舱门会自动打开。
    4.3
    用手指将试管架下方的金属按键向里侧按(见下图中白色箭头),试管架将会解除锁定并弹出,然后可以轻轻抽出试管架。


    试管架的取出方式

    4.4
    按住试管架右侧的黑色按钮,向左侧打开金属盖。放入相应的试管后,轻轻合上金属盖。听到“咔”声,表明金属盖已经处于锁定状态。
    4.5
    将试管架沿着卡槽轻轻推入样品舱,听到“咔”声,表明试管架已经处于正确位置并锁定。


    试管架的放入方式

    4.6
    点击Eject Rack Tray对话框中的OK,试管架会被自动送入样品舱,舱门也会自动合上。注意:样品舱舱门打开后会有时间限制,打开60秒后舱门将自动合上。最后15秒时,对话框中的倒数计时会显示为红色字体并闪烁。此时请不要强行将试管架放入,以免夹到手。可以等待舱门合上后,重新打开即可。

二、样品准备
  1. 运行缓冲液:本实验缓冲液选用的是HBS-EP,将10× HBS-EP稀释10倍,至少配置500 ml 的运行缓冲液,根据实验不同调整缓冲液的配置量。
  2. 配体浓度:用醋酸钠将配体溶液稀释至20 μg/ml,200 μl(至少保证1:10的稀释比)。醋酸钠最适pH需根据预富集实验确定。

三、样品检测过程
  1. 配体偶联
    1.1
    打开Biacore T200 Control Software,点击File下面的Open/New wizard template,选择immobilization。对话框中,在Chip type中选CM5,在Flow cells per cycle选4,仪器一次偶联4个通道。勾选Flow cell 1,2,3,4, method 选用amine氨基偶联,ligand输入配体名称,该实验选用specify contact time and flow rate,contact time 输入420s(垂钓实验需要高偶联,可延长进样时间提高偶联量),流速一般设为10 μl/min。接着按Next,勾选Prime before run,选择实验温度,一般默认25 °C。



    1.2
    在左侧下拉菜单中选用Sample and Reagent Rack 1,系统会自动排好样品放置位置(可以通过鼠标拖拽重新安排)。根据样品架位置表,准备足够体积的样品(如果使用的是带盖的EP管,所有盖子必须剪去)。100 μl 的EDC放入R1D1,100 μl 的NHS放入R1D2,空管放入R1D3,140 μl 乙醇胺放入R1D 4,138 μl 20 μg/ml配体蛋白放入R1D5。盖上试管架盖子,将样品架送回样品舱。



    1.3
    点击Next,弹出Prepare Run Protocol对话框,确认运行缓冲液体积大于表中的最低要求,点击start。



    1.4
    保存method与result文件到文件夹。系统正式自动运行偶联程序,整个过程耗时约40 min。软件自动生成偶联结果,建议最终偶联量大于10000 RU。



  2. 在打开的Biacore T200 Control Software里点开File中的Open/New Method。



  3. 在Biacore Methods里双击Inject and recover。



  4. 在Method Builder界面中,Overview和General Setting无需修改,点Assay Steps里的Inject and Recover,修改number ofreplicates,推荐10-20次以便收集到足够量的样品进行质谱检测。



  5. 在Cycle Types界面里,Inject and Recover,首次实验推荐使用默认参数,后期可以根据样品情况调整contact time, flow rate,incubation time等,wash solution和recovery solution默认为0.5% TFA,也可以根据样品情况使用0.2%-1%TFA, 甲酸,乙酸或再生溶液等。Deposition solution为50 mM NH4HCO3。若使用的是非酸性washsolution,Deposition solution 可以取消或用runningbuffer代替。



  6. 点击Setup Run,Flowpath选择1,2,3,4,点Next。勾选Prime before run,默认实验温度为25 °C。



  7. 点Next进入Rack Position界面,Reagent Rack默认为Sample and Reagent Rack1。



    点开Menu后选Automatic Positioning进入下面界面后,将Pooling 一栏全部改为Yes,Vial Size根据需求进行调整,调整后样品放置图如下。



  8. 根据样品所在位置进行样品准备和放置。D1放置290 μl 的NH4HCO3,浅绿色D2-D11均放置空的1.5 ml EP管,F1-F3 放置4.0 ml 的玻璃瓶,分别装入1,350 μl 样品,3,321 μl 0.5% TFA, 1,610 μl 0.5% TFA。点Next后,对方法进行保存,再对数据路径进行保存,仪器便会开始自动运行,candidate被回收到空的EP管中。
  9. 合并所有EP管中回收到的样品,送质谱。
  10. 对照组实验:用一张新的CM5芯片,不做配体偶联,直接在空白CM5芯片上进行Injectandrecover,垂钓的实验操作与参数同实验组,回收到的样品作为negative control打质谱。

结果与分析

  1. 打开数据分析软件Biacore T200 Evaluation Software,点File 中的Open找到文件。



  2. 接着点All sensorgrams。每个cycle 重复5次,每次均做一次结合与回收,每次都能结合并回收到candidate。



  3. 质谱结果,表征垂钓出的物质结构。


    对照组样品质谱结果,有很多信号峰


    实验组垂钓后的样品质谱结果,只有一个信号峰
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